تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

الجزء 1 : وصفها نيون من [كدنا]

Cy3 الصبغة التي استخدمت في التجربة ميكروأري حساسة للتدهور ، الصورة. وينبغي إجراء تجري في كمية ضئيلة من الضوء. تم تعديل بروتوكول وضع العلامات من CGH صفيف BioPrime نظام وضع العلامات الجينية المختصر ^1.

1. يتم تخزين المواد الكاشفة للتفاعل في وضع العلامات -20 درجة مئوية. من CGH صفيف BioPrime الجينوم نظام الملصقات أذاب 2.5X الاحتياطي التمهيدي عشوائية ، 10X مزيج dCTP والمياه nuclease خالية. ذوبان الجليد أيضا صبغ Cy3 - dCTP. بعد ذوبان الجليد ، الطرد المركزي لفترة وجيزة فقط قبل استخدام الكواشف.
2. وهناك رد فعل منفصل الوسم يتعين الانتهاء لكل عينة لتحليلها [كدنا]. في أنبوب 0.6 مل سميكة الجدران إضافة 500 نانوغرام [كدنا] ، 40 ميكرولتر 2.5X الاحتياطي التمهيدي عشوائية والمياه الخالية من nuclease لتحقيق وحدة تخزين ما مجموعه 86 ميكرولتر.
3. مزيج جيد وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان رد فعل لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية على thermocycler.
4. نقل على الفور الى رد فعل الجليد الطين الحمام لمدة 10 دقيقة.
5. إضافة إلى كل أنبوب ثم 10 ميكرولتر مزيج dCTP 10X ، 2 ميكرولتر Cy3 1 ملم ، و 2 ميكرولتر dCTP الحمض النووي بوليميريز Klenow إكسو. ينبغي ترك الحمض النووي بوليميريز Klenow إكسو في الثلاجة لحين الحاجة إليها ، وينبغي أن تظل دائما على الجليد.
6. مزيج رد فعل جيد وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
7. رد فعل على احتضان 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في thermocycler.

الجزء 2 : [كدنا] من الأمطار إعتبر

1. قبل الشروع في الاستمرار في تشغيل بروتوكول بشأن نظام التهجين NimbleGen والسماح للنظام للتوازن إلى 42 درجة مئوية.
2. لكل رد فعل ، ومكان عمود Microcon في أنبوب مل 1.5. إضافة 300 ميكرولتر 0.1X SSC إلى كل عمود تليها محتويات رد فعل الوسم (100 ميكرولتر).
3. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على عمود في XG 16100 لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية.
4. تجاهل من خلال تدفق ، والذي قد يكون وردي قليلا في اللون ، وإضافة 300 آخرين ميكرولتر 0.1X SSC إلى العمود.
5. كرر الطرد المركزي في 16100 XG لمدة 10 دقائق على 4 درجات مئوية.
6. تجاهل وتدفق من خلال إضافة 300 ميكرولتر إضافية 0.1X SSC إلى العمود.
7. الطرد المركزي في 16100 XG لمدة 12 دقيقة على 4 درجات مئوية.
8. تتدفق من خلال تجاهل. ينبغي أن يكون واضحا من خلال تدفق بعد ذلك اغسلي الماضي ويجب أن تكون قادرا على رؤية [كدنا] الوردي المسمى على العمود.
9. تطبيق 100 ميكرولتر nuclease خالية من المياه إلى العمود. إزالة عمود من الأنبوب مل 1.5 و عكس العمود في أنبوب جديد مل 1.5.
10. الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. وينبغي ممهى [كدنا] المسمى في المياه التي تتجمع في الجزء السفلي من الأنبوب.
11. استخدام NanoDrop ND - 1000 معمل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لحساب تركيز الحمض النووي وتقييم إدماج الصبغة عن طريق حساب نسبة قاعدة لصبغ حيث النوكليوتيدات Cy3 إلى نسبة تعادل ₂₆₀ ألف / A ₅₅₀ مضروبا نسبة 23.15. وينبغي أن القاعدة لتكون نسبة الصبغة بين 50 و 80.
12. إذا [كدنا] إذا صفت بما فيه الكفاية ، قسامة 6 ميكروغرام من المسمى [كدنا] في أنبوب جديد مل 1.5.
13. مزيج من حجم 0.1X NaOAc م 3 ، ودرجة الحموضة 5.2 و 1X حجم الأيزوبروبانول. السماح لاحتضان الخليط في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
14. الطرد المركزي القادم في العينة 16100 XG لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. بعناية تجاهل طاف دون الإخلال بيليه الحمض النووي ، التي ينبغي أن تكون في اللون الوردي.
16. إجراء غسل الايثانول بإضافة 500 ميكروليتر EtOH 70 ٪ ومزيج لطيف من خلال انقلاب.
17. أجهزة الطرد المركزي في 16100 عينة XG لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
18. إزالة طاف ، عكس الأنبوب ، والسماح للبيليه لتجف لمدة 5 دقائق. في هذه الخطوة قد تكون مخزنة في بيليه -20 درجة مئوية أو إذا كان المطلوب لا يمكن أن تستمر على بروتوكول للخطوة التهجين.

الجزء 3 : التهجين

ويتم تكييف الإجراء التهجين من دليل المستخدم روش NimbleGen صالحة للتحليل الجينات ^2.

1. حل بيليه في 5 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه.
2. حالما يتم حل بيليه إضافة مكونات التهجين المدرجة في الجدول 1. المكونات هي من تهجين تهجين روش NimbleGen كيت. بعد إضافة كافة مكونات يجب أن الحجم الإجمالي الكلي الآن 18 ميكرولتر. مزيج جيد وتدور لفترة وجيزة في الأنبوب لجمع محتويات في القاع.
3. الخطوة التالية هي أن تفسد المسمى [كدنا] بوضعه على كتلة في الحرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. نقل على الفور إلى نظام أنبوب تهجين NimbleGen بينما أعدت المصفوفات في الخطوات التالية.
5. ويجب دائما أن تعالج بعناية ميكروأرس وتخزينها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. روش NimbleGen توصي تخزين صفائف التعبير عنها في الظلام مع المجففة في درجة حرارة الغرفة.
6. تحميل الصفيف في محاذاة أداة دقيقة خلاط (PMAT) المنصوص عليها في تجهيز الاكسسوارات NimbleGen الصفيف.
<لى> تحميل خلاط X1 على لPMAT وإزالة الشريط اللاصق بالملقط. إغلاق PMAT آمن. ممارسة الضغط على خلاط من خلال ثقب في PMAT وفتح ببطء بحيث الصفيف وخالط الانفصال عن PMAT.
7. تطبق بحزم مع الضغط براير حول خارج خلاط لضمان ختم على مجموعة كاملة وإزالة أي فقاعات. مكان المجمع مجموعة خلاط على النظام التهجين إلى الدافئة.
8. باستخدام ماصة التشرد ، إضافة ببطء 15 ميكرولتر من العينة المسمى بمنفذ التعبئة. هذا هو حفرة تقع في وسط خلاط. الضغط بطيء وثابت على ماصة بحيث العينة بالتساوي ينتشر عن طريق خلاط دون أي فقاعات هواء. تمحو أي عينة الزائدة من الثقوب ثقوب المنفذ وختم منفذ بأشرطة لاصقة.
9. إغلاق مزلاج وبدء الاختلاط من الحل التهجين باستخدام برنامج B على نظام التهجين NimbleGen. ميكروأرس تسمح لهجن ل16-20 ساعة.

الجزء 4 : بعد التهجين الغسلات والمسح الضوئي للميكروأري

ويتم تكييف إجراءات الغسل والمسح الضوئي من دليل المستخدم روش NimbleGen صالحة للتحليل الجينات ^2.

1. مرة واحدة بالقرب من التهجين استكمال إعداد مخازن يغسل كما هو مبين في الجدول 2. قبل الدافئة IA اغسل الاحتياطي إلى 42 درجة مئوية في حمام مائي.
2. تشغيل الماسحة الضوئية GenePix مجموعة 4000B والسماح الماسح الضوئي لالدافئ لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
3. صب الاحتياطي اغسل قبل تحسنت IA الى الطبق.
4. إزالة مجمع مجموعة خلاط من نظام التهجين NimbleGen والانزلاق في رقصة (الموردة في تجهيز الاكسسوارات NimbleGen الصفيف). يغرق في التجمع قبل تحسنت اغسل IA العازلة وإزالة بعناية بواسطة خلاط تقشير بعيدا عن الشريحة.
5. إزالة مجموعة من تهزهز وتستنهض الهمم لمدة 15 ثانية في غسل الاحتياطي العراقي.
6. نقل بسرعة إلى رفوف مجموعة الشريحة في درجة حرارة الغرفة العازلة اغسل IB. تستنهض الهمم رف الشريحة بقوة لمدة 2 دقيقة.
7. نقل رف الانزلاق الى اغسل الاحتياطي الثاني وتستنهض الهمم لمدة 1 دقيقة.
8. نقل الانزلاق الى الرف الثالث الاحتياطي اغسل وتستنهض الهمم لمدة 15 ثانية.
9. نقل الصفيف في الشريحة التجفيف وتدور أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة لإزالة كل الرطوبة. الشروع في المسح.
10. فمن المستحسن أن تفحص على الفور مجموعة منذ صبغة حساسة للضوء والأوزون على حد سواء.
11. تحميل الصفيف ، الباركود أسفل ، في مجموعة GenePix 4000B الماسح الضوئي.
12. افتح البرنامج برو GenePix والمضي قدما لمسح الصفيف. الجين صفائف NimbleGen التعبير روش الاستفادة من لون واحد التهجين الاستراتيجية. ونتيجة لذلك مطلوب فقط طول موجة واحدة لمسح. مسح Cy3 إشارة مضان باستخدام الليزر نانومتر 532. فتح مربع الحوار إعداد الجهاز وتعيين قيمة PMT ليزر 532 نانومتر إلى قيمة 500.
13. في مربع الحوار الأجهزة الإعداد ، مجموعة الطاقة إلى 100 ٪ ، وحجم البكسل إلى 5 ميكرون ، وخطوط للمتوسط ​​إلى 1 ، والتركيز على الموقف 0 ميكرون.
14. إجراء فحص معاينة وضبط منطقة المسح الضوئي.
15. إجراء المسح الضوئي.
16. بمجرد اكتمال المسح التحقق من الرسم البياني الصورة. من الناحية المثالية يجب 1E - 5 التهم تطبيع تكون على 65000 تشبع معنى الحد الذي يتم المشبعة ~ 1-2 ٪ من الميزات. إذا كانت التهم تطبيع أقل من 1E - 5 ، وزيادة اكتساب PMT وإعادة تفحص الشريحة. إذا كانت التهم تطبيع أكبر من 1E - 5 ، وانخفاض الربح PMT وإعادة تفحص الشريحة.
17. بمجرد اكتمال المسح الضوئي حفظ الصورة. فمن المستحسن اختيار تسمية الاتفاقية الموحدة لصور لسهولة الرجوع إليها. يمكن الآن أن يتم تحميل الصور في برنامج تحليل البيانات لتفضيل للتطبيع البيانات وحساب قيم الكثافة.

ممثل النتائج

يمكنك أن تبدأ أولى لتقييم كفاءة التفاعل Cy3 العلامات مضان من [كدنا] عند بداية يغسل مع SSC 0.1X. أثناء كل غسل لاحقة ينبغي أن تتدفق من خلال تصبح أقل وردي اللون مع تدفق من خلال مشاركة واضحة. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي للCy3 المنتجات التي تحمل علامات واضحة على أن [كدنا] العمود خلال هذه الخطوات يغسل. إذا كان التدفق من خلال وردي مشرق في اللون أو لا يوجد أي منتج الوردي على العمود ، وهذا يعتبر مؤشرا جيدا على أن رد الفعل لم تشرع وضع العلامات بشكل صحيح. ويمكن تقييم رد الفعل وسم به كميا ND - 1000 NanoDrop معمل لتحديد تركيز الحمض النووي المسمى وقاعدة لنسبة الصبغة (الشكل 1). رد الفعل وسم غلة بشكل روتيني لا يقل عن 10 ميكروغرام من الحمض النووي المسمى في المختبر لدينا. ويمكن حساب التأسيس صبغة باستخدام قاعدة بسيطة / صبغ حيث نسبة النوكليوتيدات Cy3 إلى نسبة تعادل ₂₆₀ ألف / A ₅₅₀ مضروبا نسبة 23.15. قيم تتراوح 50-80 تشير إلى إدماج صبغ كافية في رد فعل التوسيم. إذا كان رد الفعل وسم غلة على تركيز منخفض من الحمض النووي أو دمج الفقراء صباغة ، وتهجين من العينة على هيئة التصنيع العسكريلا ينصح roarray وينبغي تكرار رد فعل التوسيم.

ويمكن إجراء تقييم لنوعية من خلال تقييم التهجين الرسم البياني الصورة والصورة الممسوحة ضوئيا من ميكروأري (الشكل 2). وسوف يكون مقبولا التهجين 1-2 ٪ من الميزات المشبعة (على سبيل المثال ، ينتج 1E - 5 التهم تطبيع في حد التشبع 65000) مع مجموعة قيمة PMT قرب 500. إذا كانت قيمة PMT لابد من تعديلها بشكل جذري من 500 إلى بلوغ 1E - 5 التهم تطبيع في حد التشبع 65000 ، يشير هذا التهجين الفقراء عموما من [كدنا] [ميكروأري المسمى ل. وسيتألف نوعية البيانات إذا استمرت هذه البيانات من خلال تحليل لاحقة. ويمكن أيضا أن تقيم جودة التهجين نوعيا من خلال عرض الصور الممسوحة ضوئيا من مجموعة (الشكل 3). وتهجين NimbleGen روش مجموعة تحتوي على خليط بنسبة ضئيلة محاذاة Cy3 وCy5 المسمى [أليغنوكليوتيد] 48mer أن يهجن إلى ميزات المحاذاة على المصفوفات. التقييم النوعي لشدة oligos محاذاة إلى ميزات أخرى على مجموعة تصاريح فحص الجودة على كفاءة التهجين من [كدنا] fluorescently المسمى على الصفيف. بعد مزيد من التحليل ، يمكن استخدام قطعة من البيانات مبعثر تحليلها لتحديد مستويات النسبية في التعبير الجيني وتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف بين العينات الخاصة بك (الشكل 4).

الشكل 1. ويمكن تقييم طيف من [كدنا] NanoDrop العائد المسمى مع Cy3. [كدنا] وصفت وإدماج صبغة باستخدام ND - 1000 NanoDrop معمل. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2. ويمكن تقييم والرسم البياني للجودة GenePix ميكروأري. مسح للتهجين من خلال تقييم المدرج الصورة. وسوف يكون مقبولا التهجين 1-2 ٪ من الميزات مشبعة التهم 1E 5 تطبيع في حد التشبع 65000 مع قيمة PMT قرب تعيين 500. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

الشكل 3. ويمكن تقييم ميكروأري صورة الممسوحة ضوئيا. تهجين الجودة من خلال عرض الصور الممسوحة ضوئيا من ميكروأري. ينبغي فحص صورة عن وجود الغبار أو العوامل الأخرى التي تحظر التدخل تصور كل ميزة ، وبالتالي ، منع حساب دقيق لشدة مضان من هذه الميزة. ويمكن مقارنة شدة oligos محاذاة إلى ميزات أخرى على مجموعة لتقييم كفاءة التهجين.

الشكل 4. مؤامرة مبعثر من تجربة ميكروأري تحليلها ، والهدف من هذا الإجراء هو تحديد الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف في العينات الخاصة بك. ويمكن زيادة تحليل البيانات ميكروأري وينظر في مؤامرة مبعثر لتصور الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف.

الجدول 1. المكونات من مجموعة روش NimbleGen التهجين لإضافة خطوة لتهجين 2.

الجدول 2. اغسل مخازن لتكون على استعداد لغسل المصفوفات التالية التهجين.

* تمهيدي الدافئة إلى 42 درجة مئوية

بروتوكولات [ميكروأري كثيرة ، منها واحدة مفصلة هنا ، واستخدام الأصباغ الفلورية كوسيلة للقياس الكمي والتهجين. صبغة الفلورسنت Cy3 حساس للصور وتدهور طبقة الأوزون. فمن المستحسن أن يجري الإجراء في الحد الأدنى من الإضاءة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للجزيئات الغبار الصغيرة تتداخل مع التهجين والمسح الضوئي. وينبغي إيلاء اهتمام خاص للتأكد من أن منطقة العمل نظيفة وخالية من الغبار.

هناك بدائل عديدة لبروتوكول وضع العلامات الموضحة في هذا الإجراء. فمن المستحسن أن يكون اختبار بروتوكولات مختلف العلامات لتحديد الإجراء الأمثل لوضع العلامات لكل منصة التعبير ميكروأري محددة. وقد تم تحسين الإجراء أثبت هنا للتعبير هذا المنبر مجموعة محددة أوردتها NimbleGen روش. بالإضافة إلى ذلك ، لقد تم العثور على بروتوكول وضع العلامات مفصلة في دليل المستخدم صفيف NimbleGen روش في العمل بنفس القدر أيضا. وينبغي توخي الحذر إذا تطبيق هذا البروتوكول إلى غيرها من المنصات صفيف التعبير ، لا سيما من الشركات المصنعة الأخرى ، وتخضع إلى حد كبير خصائص التهجين وفقا للأساليب الطباعة من المنصة.

اقتران هذا البروتوكول صفيف التعبير إلى العزلة والحمض النووي الريبي لدينا [كدنا] بروتوكول التوليف غلة روتيني استنساخه الجينات ذات الجودة العالية البيانات صفيف التعبير في المختبر لدينا. هذا هو هدف مهم للجميع التحليلات صفيف التعبير في أن نوعية البيانات النهائية تعتمد في نهاية المطاف على نوعية هذه الخطوات الأولية. سيكون أقل من النتائج المثلى في أي واحدة من هذه الخطوات التي تؤدي إلى تحليل التعبير الصفيف النهائي تعوق نوعية البيانات النهائية.

الإجراءات الواردة في هذا الفيديو من العلامات الفلورية من [كدنا] إشارة إلى اقتناء هو الإجراء القياسية لتحليل مجموعة من التعبير المستقل مسألة تجريبية. الاتجاه الذي المضي قدما لتحليل البيانات صفيف التعبير التالي الحصول على الصور وتعتمد بشكل كبير على كل تجربة محددة.