Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Del 1: fluorescerande märkning av cDNA

Den Cy3 färgämne som används i microarray experiment är känslig för foto-nedbrytning. Förfarandet bör ske i en minimal mängd ljus. Märkningen protokoll var anpassad från BioPrime Array CGH Genomic märkningssystem Manuell ^1.

1. Reagenserna för märkning reaktionen lagras vid -20 ° C. Från BioPrime Array CGH Genomic märkningssystem tina 2,5 X Slump Primer buffert, 10X dCTP mix, och nukleasfritt vatten. Även Tina Cy3-dCTP färgämne. Efter upptining, kort centrifug alla reagenser innan användning.
2. En separat märkning reaktion kommer att behöva fyllas i för varje cDNA prov som ska analyseras. I en 0,6 ml tjockväggiga röret lägga 500 ng cDNA, 40 l 2,5 X Slump Primer Buffer och nukleasfritt vatten för att uppnå en total volym på 86 l.
3. Blanda väl och kort centrifugering. Inkubera reaktion i 5 minuter vid 100 ° C på en termocykler.
4. Överför omedelbart reaktionen i ett isbad slam i 10 minuter.
5. För varje rör sedan lägga 10 l 10X dCTP mix, 2 l 1 mM Cy3-dCTP och 2 l Exo Klenow DNA-polymeras. Den Exo Klenow DNA-polymeras ska lämnas i frysen tills det behövs och bör alltid hållas på is.
6. Blanda reaktion väl och kort centrifugering.
7. Inkubera reaktion vid 37 ° C i 16 timmar i en termocykler.

Del 2: Utfällning av märkt cDNA

1. Innan du fortsätter i protokollet slå på NimbleGen Hybridisering systemet och låta systemet att jämvikt till 42 ° C.
2. För varje reaktion, placera en Microcon kolumn till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 300 l 0,1 x SSC varje kolumn följt av innehållet i den märkning reaktionen (100 l).
3. Centrifugera röret med kolonnen med 16.100 xgi 10 minuter vid 4 ° C.
4. Kasta flödet genom, som får vara lätt rosa färg, och lägga till ytterligare 300 l 0,1 x SSC till kolumn.
5. Upprepa centrifugering vid 16.100 xgi 10 minuter vid 4 ° C.
6. Kasta flödet genom och lägg till ytterligare 300 l 0,1 x SSC till kolumn.
7. Centrifugera vid 16.100 xgi 12 minuter vid 4 ° C.
8. Kasta passera. Flödet genom bör vara tydligt efter denna sista tvättningen och du bör kunna se den rosa märkt cDNA på kolumnen.
9. Tillsätt 100 l nukleasfritt vatten kolumn. Ta bort kolumn från 1,5 ml rör och invertera kolumn till en ny 1,5 ml rör.
10. Centrifugera vid 2300 xgi 2 minuter vid 4 ° C. Det märkta cDNA bör rehydreras i vattnet som samlas på botten av röret.
11. Använd en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer enligt tillverkarens anvisningar för att beräkna DNA-koncentration och utvärdera färgämnet införlivande genom att beräkna basen att färga förhållandet där nukleotid att Cy3 förhållandet är lika med A ₂₆₀ / A ₅₅₀ kvoten multiplicerad med 23,15. Basen att färga förhållandet skall vara mellan 50 och 80.
12. Om cDNA om märkt tillräckligt, delprov 6 mikrogram märkt cDNA in i ett nytt 1,5 ml rör.
13. Blanda i 0,1 x volym på 3 miljoner NaOAc, pH 5,2 och 1x volym isopropanol. Låt blandningen inkubera i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur.
14. Nästa Centrifugera provet vid 16.100 xgi 20 minuter i rumstemperatur.
15. Försiktigt kassera supernatanten utan att störa DNA-pellets, som bör vara rosa.
16. Gör en etanol tvätta genom att lägga till 500 l 70% EtOH och blanda genom att vända försiktigt.
17. Centrifugera provet vid 16.100 xgi 5 minuter vid rumstemperatur.
18. Avlägsna supernatanten, invertera röret, och låt pellets torka i 5 minuter. I detta steg pelleten kan förvaras vid -20 ° C om så önskas eller protokollet kan fortsätta till hybridisering steg.

Del 3: hybridisering

Det hybridisering förfarandet är anpassat från Roche NimbleGen Arrays användarhandboken för Gene Expression Analysis ^2.

1. Lös upp pelleten i 5 ìl nukleasfritt vatten.
2. När pellets är upplöst lägga hybridisering komponenter som anges i tabell 1. Hybridisering komponenter från Roche NimbleGen hybridisering Kit. Efter att alla komponenter läggs den totala volymen bör nu totalt 18 l. Blanda väl och kortfattat snurra röret för att samla innehållet i botten.
3. Nästa steg är att denaturera märkt cDNA genom att placera den på ett värmeblock vid 95 ° C i 5 minuter.
4. Överför omedelbart röret till NimbleGen Hybridisering systemet medan arrayer bereds i följande steg.
5. Microarrays bör alltid hanteras varsamt och förvaras enligt tillverkarens anvisningar. Roche NimbleGen rekommenderar att lagra sitt uttryck arrayer i mörkret med torkmedel vid rumstemperatur.
6. Ladda arrayen i Precision Mixer Alignment Tool (PMAT) som föreskrivs i NimbleGen tillbehör matrisbearbetning.
<li> Ladda en X1 mixer på PMAT och ta bort den självhäftande remsan med tång. Stäng PMAT ordentligt. Sätta press på mixern genom hålet i PMAT och långsamt öppna så att arrayen och mixer lossnar från PMAT.
7. Fast utöva påtryckningar med brayer runt utsidan av mixern så att tätningen till matrisen är klar och att avlägsna eventuella bubblor. Placera array-mixern komplex på hybridisering systemet för att värma.
8. Med hjälp av en förskjutning pipett långsamt lägga 15 ìl av märkt provet i påfyllningsöppningen. Detta är hålet i mitten av mixern. Applicera långsamt och stadigt tryck på pipetten så att provet sprids jämnt via mixern utan luftbubblor. Torka bort överflödig prov från hamnen hålen och försegla porten hål med självhäftande remsor.
9. Stäng spärren och börja blandning av hybridisering lösningen med hjälp av program B på NimbleGen hybridisering System. Låt microarrays att hybridisera i 16-20 timmar.

Del 4: Post-hybridisering Tvättar och inläsning av microarray

Tvätten och skanning förfarande är anpassat från Roche NimbleGen Arrays användarhandboken för Gene Expression Analysis ^2.

1. När hybridisering nära sin fullbordan förbereda tvätta buffertar som beskrivs i tabell 2. Pre-varm tvättbuffert IA till 42 ° C i ett vattenbad.
2. Slå på GenePix 4000B rad skanner och låta scannern värmas i ca 15 minuter före användning.
3. Häll förvärmda IA ​​tvättbuffert i en skål.
4. Ta bort array-mixern komplex från NimbleGen Hybridisering systemet och skjut in jiggen (levereras i NimbleGen tillbehör matrisbearbetning). Sänk montering i förvärmda tvättbuffert IA och försiktigt bort blandaren genom att dra bort från bilden.
5. Ta bort rad från jiggen och skaka i 15 sekunder i tvättbuffert IA.
6. Snabbt överföra array i en bild rack i tvätten rumstemperatur Buffer IB. Skaka bilden rack kraftigt i 2 minuter.
7. Överför bilden rack i tvättbuffert II och skaka i 1 minut.
8. Överför bilden rack i tvättbufferten III och skaka i 15 sekunder.
9. Överför arrayen i bilden torkning centrifugen och snurra i 2 minuter för att avlägsna all fukt. Gå vidare till skanning.
10. Det rekommenderas att skanna arrayen direkt eftersom färgen är känslig för både ljus och ozon.
11. Ladda arrayen, streckkod ner, in i GenePix 4000B array scanner.
12. Öppna GenePix Pro och gå vidare till skanning av arrayen. Den Roche NimbleGen genuttryck arrayer använder en strategi färg hybridisering. Som ett resultat av bara en våglängd krävs för skanning. Scan Cy3 fluorescenssignalen med 532 nm laser. Öppna hårdvara inställning dialogrutan och ställa in PMT värdet på 532 nm laser till ett värde av 500.
13. I hård inställning i dialogrutan som makten till 100%, pixelstorlek till 5 mikrometer, linjer i genomsnitt till 1, och fokuserar position till 0 mikrometer.
14. Utför en förhandsvisning skanning och ställa skanningsområde.
15. Utför sökning.
16. När skanningen är klar kontrollerar bilden histogrammet. Helst 1e-5 normaliserade räknas bör vara 65 tusen mättnad limit innebär att ~ 1-2% av de funktioner som är mättade. Om den normaliserade räknas är mindre än 1E-5, öka PMT vinst och scanna bilden. Om den normaliserade räknas är större än 1E-5, minska PMT vinst och scanna bilden.
17. När skanningen är klar spara bilden. Det rekommenderas att välja en standard namnkonvention för bilder för att underlätta i referens. Bilden kan nu laddas in i dataanalys programmet om preferens för uppgifter normalisering och beräkning av intensitet värden.

Representativa resultat

Du kan först börja att bedöma effektiviteten i Cy3 fluorescens märkning reaktion cDNA när början tvättar med 0,1 x SSC. Under varje efterföljande tvätta flödet genom bör bli mindre rosa med sista flödet genom tydliga. Dessutom bör Cy3-märkt cDNA produkt vara synliga på kolumnen under dessa tvätta steg. Om flödet genom är ljust rosa eller så finns inga rosa produkt på kolumnen, är detta en bra indikation på att märkningen reaktionen inte gick korrekt. Märkningen reaktionen kan bedömas kvantitativt med hjälp av NanoDrop ND-1000 spektrofotometer för att fastställa koncentrationen av märkta DNA och bas att färga förhållande (figur 1). Märkningen reaktionen ger rutinmässigt minst 10 mikrogram av märkta DNA i vårt laboratorium. Dye inbyggnad kan beräknas med hjälp av en enkel bas / färg förhållande där nukleotid att Cy3 förhållandet är lika med A ₂₆₀ / A ₅₅₀ kvoten multiplicerad med 23,15. Värden mellan 50 till 80 indikerar tillräcklig färg ingå i märkningen reaktionen. Om märkningen reaktion ger en låg koncentration av DNA eller dålig färg bolagsordning, hybridisering av provet på microarray rekommenderas inte och märkning reaktion bör upprepas.

Bedömning av kvaliteten på hybridisering kan ske genom att utvärdera bilden histogram och den scannade bilden av microarray (Figur 2). Acceptabel hybridizations kommer att ha 1-2% av mättade funktioner (dvs. ger 1E-5 normaliserade räknas på 65 tusen mättnad gränsen) med PMT värdet ligger nära 500. Om PMT värdet måste justeras drastiskt från 500 för att nå 1E-5 normaliserade räknas på 65 tusen mättnad gräns, betyder det i allmänhet dålig hybridisering av de märkta cDNA till microarray. Datakvaliteten kommer att bestå, om dessa uppgifter fortsatte genom den efterföljande analysen. Hybridisering kvalitet kan också bedömda kvalitativt genom att titta Bilderna av de inlästa array (Figur 3). Den Roche NimbleGen Hybridisering Kit innehåller en blandning anpassning oligo av Cy3-och Cy5-märkt 48mer oligonukleotider som hybridiseras till anpassning funktioner på kedjor. Kvalitativ bedömning av intensitet anpassning oligos till andra funktioner på matrisen möjliggör en kvalitetskontroll på hybridisering effektivitet fluorescerande cDNA på matrisen. Efter ytterligare analys kan ett punktdiagram av analyserade data användas för att bestämma de relativa nivåerna på genuttryck och för att identifiera gener som differentiellt uttrycks mellan dina prover (Figur 4).

Figur 1. En NanoDrop spektrum från cDNA Märkta märkta med Cy3. CDNA avkastning och färgämnet införlivandet kan bedömas med hjälp av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2. En GenePix histogrammet för microarray scan. Kvalitet på hybridisering kan bedömas genom att utvärdera bilden histogrammet. Acceptabel hybridizations kommer att ha 1-2% av de funktioner mättat med 1E-5 normaliserade räknas på 65 tusen mättnad gränsen med PMT värdet ligger nära 500. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Figur 3. En skannad microarray bild. Hybridisering kvaliteten kan bedömas genom att titta på skannade bilden av microarray. Bilden bör undersökas för förekomst av damm eller andra störande faktorer som förbjuder visualisering av varje funktion och därmed förhindra korrekt beräkning av den fluorescens intensiteten i funktionen. Intensiteten i anpassningen oligos kan jämföras med andra funktioner på matrisen att bedöma hybridisering effektivitet.

Figur 4. Ett punktdiagram av ett analyserat microarray experiment. Målet med detta förfarande är att identifiera gener som differentiellt uttrycks i dina prover. Microarray data kan analyseras ytterligare och ses i ett punktdiagram för att visualisera gener som differentiellt uttrycks.

Tabell 1. Komponenter från Roche NimbleGen Hybridisering Kit för att lägga till hybridisering steg 2.

Tabell 2. Tvätta buffertar för att vara förberedd för tvätt av matriser efter hybridisering.

* Pre-varmt till 42 ° C

Många microarray protokoll, inklusive en detaljerad här, använda fluorescerande färger som ett sätt att mäta och kvantifiera hybridisering. Den Cy3 fluorescerande färg är känslig för foto och ozon nedbrytning. Det rekommenderas att förfarandet genomföras på minimal belysning. Dessutom kan små dammpartiklar störa hybridisering och skanning. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att se till att arbetsområdet är rent och fritt från damm.

Det finns många alternativ till märkning protokoll som beskrivs i detta förfarande. Det rekommenderas att olika märkning protokoll testas för att fastställa den optimala märkning proceduren för varje specifikt uttryck microarray-plattform. Förfarandet har visat här har optimerats för denna specifika uttryck samling plattform tryckt av Roche NimbleGen. Dessutom har vi funnit märkningen protokollet beskrivs i Roche NimbleGen Array bruksanvisning för att fungera lika bra. Försiktighet bör iakttas vid tillämpningen av detta protokoll till andra plattformar uttryck array, särskilt från andra tillverkare, som hybridisering fastigheter är till stor del styrs av tryckmetoder av plattformen.

Koppling detta protokoll uttryck utbud till våra RNA isolering och cDNA syntes protokoll rutinmässigt ger reproducerbar hög kvalitet gen uppgifter uttryck rad i vårt laboratorium. Detta är ett viktigt mål för alla analyser uttryck array i att den slutliga datakvalitet är ytterst beroende av kvaliteten av dessa första steg. Mindre än optimalt resultat på någon av dessa steg som leder till det slutliga uttrycket array analys kommer att hämma kvaliteten på de slutliga uppgifterna.

De förfaranden som presenteras i denna video från fluorescerande märkning av cDNA att signalera förvärv är standardförfarande för uttryck rad analys oberoende av experimentella frågan. I vilken riktning att gå vidare för analys av de data som uttrycket array Följande bild förvärvet är till stor del beroende av varje specifik experiment.