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脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

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Cite this Article: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).

Abstract: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

这个协议描述的增长和刺激，与同位素重工业和轻工业的酿酒酵母细胞，脂肪酸油酸。细胞是地面使用球磨机研磨机和解决方案所带来的尿素增溶产生的grindate的一个cryolysis程序。此过程允许在新陈代谢处于非活动状态的细胞裂解，维护的磷酸化和防止细胞裂解过程中的磷酸化的方向调整。以下还原，烷基化，胰蛋白酶消化的蛋白质，样品脱盐C18柱和样品的复杂性，降低了使用亲水作用色谱（HILIC）分馏。 HILIC列优先保留，这是适合用于磷酸化的亲水性分子。磷酸化肽往往比非磷酸化的同行色谱个人资料后洗脱。分馏后，使用固定的金属色谱仪，依赖基于电荷的亲和力磷酸浓缩磷酸化是丰富。在此过程结束后的样品准备质谱定量分析。

Protocol: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

细胞生长和媒体

  1. 1.0然后将两个1公升文化的一个最小的酵母培养基（0.17％酵母无氮基硫酸铵或氨基酸，0.5％的硫酸铵）的种子细胞，在100 毫升到外径600富媒体BY4742Δarg4Δlys1过夜的一个单菌落含有充分补充氨基酸，辅以20毫克/ L的同位素正常或重精氨酸（13 6 15 N 4的 ; Isotec）和赖氨酸（13 C 6 H 15 N 2; Isotec）。
  2. 细胞生长18小时，1.8 OD 600。这是至关重要的，至少有9代细胞通过去实现全面纳入标记同位素。光样品的颗粒，用无菌水冲洗，reseeded成一个含中等（同位素正常的精氨酸和赖氨酸，0.2％，油酸（适马化工）和0.5％吐温40（适马化工））的油酸和另外85分钟的刺激。这将产生一个同位素轻，精氨酸和赖氨酸，油酸刺激样本和同位素重的葡萄糖生长的参考样本。

细胞裂解，分离和分馏多肽

  1. 称取离心瓶。收获样品离心3分钟。删除媒体和吸出多余的液体。称取颗粒和一瓶（通常会产生1-2克之间）然后在液氮中的闪光冻结。添加量相当于颗粒重量的“磨”缓冲区在液氮冷冻颗粒（磷酸盐缓冲液（PBS，GIBCO），10％的甘油，蛋白酶抑制剂（SigmaFAST蛋白酶抑制剂片，西格玛），并停止磷酸酶抑制剂（Thermo Scientific的））。
  2. 液氮冷冻研磨容器。等待，直到液氮停止沸腾。转移颗粒研磨容器，冷冻球轴承。
  3. 在600 RPM研磨1分20秒周期为3分钟的方向逆转。重新冷冻在液氮的研磨容器。总研磨时间为15分钟，重复4次以上。
  4. 收集到一个50毫升猎鹰管处干冰冷冻grindate。贮存于-80 ° C直到准备使用。
  5. 设为一个8M的尿素，0.1M碳铵，0.1M的Tris pH值8.610毫升溶液。新增3卷尿素缓冲冰冻grindate 1卷（1 ml PBS缓冲液中添加1革兰氏颗粒尿素缓冲的例子3mls）。超声立即用探针尖端sonicator（2 - 10个脉冲）的混合物。保持解决方案的发泡管，以防止底部附近的一角。 grindate应立即进入解决方案。
  6. 5分钟清除裂解液离心4 ° C。
  7. 上清转移到新鲜管。
  8. 新鲜的0.5M三等分[2 - 羧乙基]膦（TCEP）。 5mm的终浓度为1:100添加到样品。在37 ° 1小时
  9. 烷基化降低半胱氨酸。允许冷却到室温。做一个新鲜的等分1M碘乙酰胺。在黑暗中保持（我们管包装箔）。加入终浓度为20mm。在室温下1小时在黑暗中孵育。
  10. 淬火与1M股票在室温下1小时20mm的数码地面电视的碘乙酰胺
  11. 量化的一个标准布拉德福德或BCA法测定蛋白（没有说明）。采取下面的SDS - PAGE进行分析的样品。
  12. 为了验证注册成立的重同位素，使用100μL减少和烷基化裂解。 DH 2 O 1:4稀释，超声和胰蛋白酶的50:1蛋白质添加胰蛋白酶。消化至少4小时，干样品，然后用C18 Ultramicrospin列（鸟巢集团）VAC和淡化的速度下降。
    1. 水合物列100μL乙腈
    2. 与200μL0.1％TFA平衡。
    3. 重悬于200μL0.1％TFA的干样品。加载到列。离心〜200 XG或最小流量的速度需要通过列。
    4. 洗两次与200μL0.1％TFA。
    5. 洗脱与50μL60％的乙腈，0.1％TFA的两倍。
    6. 干样的速度VAC。
    7. 悬浮样品在20μL0.1％甲酸。运行2μL质谱仪。检查同位素重的精氨酸和赖氨酸10和8道尔顿的转变，在各自的m / z光谱法团。每个氨基酸纳入应在96 - 98％之间。
  13. 混合样品同位素重型和轻型等值金额（毫克的蛋白质）。
  14. 用20％甲醇稀释样品1:4。
  15. 添加胰蛋白酶1:200。过夜孵育在37 ° C。
  16. 检查SDS - PAGE，消化已经完成。运行2和4μL简化样品和8D 16μL后胰蛋白酶消化。考马斯染色的可视化，消化完全。如果它是不完整的的，用探针尖端sonicator简要超声样品，并再次用胰蛋白酶消化。
  17. 干燥的样品，在速度VAC。干燥时添加至沉淀成溶液200μL过滤生署2 O和旋涡。干样品下降速度VAC。再次重悬与DH 2 O。再次干样品​​。
  18. 悬浮颗粒0.1％Trifluoracetic乙酸（TFA;西格玛）。检查的pH值约为3，使用pH值条。如果需要的10％TFA酸化。
  19. 佩莱出任何沉淀。
  20. 一个水域SEP - PAK吸尘器500毫克C18柱脱盐样品。不要超负荷这些列。最高金额为5毫克，但它的更好的负载少一些。分成多个列之间如果有必要的样品。
    1. 水合物列5毫升100％乙腈。离心〜200 XG或最小流量的速度需要通过列。
    2. 用5ml 0.1％TFA平衡列。装入样品。收集流动和重新加载。
    3. 洗5毫升0.1％TFA。重复。
    4. 洗脱与2毫升60％乙腈，0.1％TFA的。
    5. 干样品下降速度VAC。

磷酸肽分馏和分离

  1. 肽是在HILIC列分割。我们使用TOSOH TSK - GEL酰胺 - 80 4.6毫米× 25厘米与保护柱分析柱。以你的时间，这一步在90％以上的运行2个小时的A列，然后运行两个空白梯度加载你的样品之前。在这种规模被认为是周围二十列的最大负载，我们通常不负载超过5毫克每运行。
  2. 溶剂A - 98％ACN/0.1％TFA
    溶剂B - 2％ACN/0.1％TFA
    负载超过20“，90％至85％，比5'，85％在90％到60％超过40”，60％，超过5 0％“，0％到90％ 5“。
  3. 流速为1ml/min，分数分别为85％至60％的梯度开始，每隔2分钟收集。
  4. 结合分数减少到10的分数。增加分数可能会带来更大的磷酸化的覆盖面。

富集磷酸化

  1. 磷酸丰富，采用磷酸选择铁亲和凝胶。我们等分IMAC树脂，以避免重复冷冻解冻。使250毫米醋酸，30％的乙腈负载溶液50毫升。用HCl使pH值至2.7。重悬浮颗粒负载的解决方案在500μL。检查pH值，用盐酸或氢氧化钠进行必要的调整。
  2. 预洗200μL的iMac珠在适当的列。我们使用Molbiotec的离心柱。
    添加到每个分数的50％的泥浆（凝胶负载的解决方案）15μL，孵育30样本“，对年底旋转结束。保持流量进行分析。
  3. 洗净，与负载的解决方案样品3次，一次用500μL的过滤 生署 2 O
  4. 2 - 3分钟400 50毫米的Na 2 HPO 4（pH值8.4）缓冲液洗脱肽。转移到玻璃小瓶。
  5. 酸化至pH 3 5μL100％甲酸，闪光灯在液态氮冷冻，干燥样品速度VAC。
  6. 在200微升0.1％TFA和C18清洁如上所述，悬浮的磷酸化。干燥速度VAC洗脱样品。
  7. 重悬在20μL的0.1％甲酸肽。使用2μL每质谱仪分析，或根据需要。

注释

本议定书的大部分时间，你会被“瞎子”。细胞裂解液，可以监测免疫印迹和布拉德福德或BCA法检测，胰蛋白酶消化，还可以随时评估。 HILIC列了跟踪与此类似，或由其他[1，2]根据液相色谱机，用于见过。样品质谱监测; LCQs或之前，会在一个高的质量精度，高分辨率机高的成本分析MALDIs如廉价的机器上测试您的样品。最后，如​​果你干燥的样品与酸中，用玻璃。

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Discussion: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

这种方法将产生一个可定量分析的磷酸化的浓缩。在这个协议中许多参数可以改变，但要记住的最重要的方面是保护您的磷酸。定量细胞的制备，可在许多不同的方式实现，例如，如果你可以没有标签在体内，如作为ICAT标记你的细胞[3]或iTRAC工作[4]可以被使用后提取到不同的标签两种文化的量化目的。

最常见的方法进行分馏凝胶SDS - PAGE [5，6]分馏，SCX色谱法[7]，并基于HILIC色谱法[1，2]。我们选择HILIC，因为它保留，直到梯度结束肽，而在前面的梯度洗脱SCX但有其他团体与其他方法的良好成功。

当使用的iMac，您可能需要增加或减少树脂的使用量，培养时间或清洗。也有研究，寻找改变负载的解决方案，我们在座的[8]的初步化学。这相结合的方法，应允许60％至95％的磷酸化之间的样本，隔离。一旦你建立了一个适合您特定系统的方法，你应该能够磷酸化收益率更高的优化。

的磷酸化肽段的富集也可以实现与二氧化钛或亚磷化学[9，10] [11，12]，有研究表明，每个方法将产生重叠的磷酸化不同的部分[13] 。

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Disclosures: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

Acknowledgements: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

我们要感谢丰富的罗杰斯博士与质谱分析和有益的讨论，提供技术援助和Drs。罗布莫里茨，杰夫Ranish，哈米德有益的讨论Mirzai。

这项工作是由美国国立卫生研究院的卓越中心。

Materials: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

Name Company Catalog Number Comments
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 Sigma-Aldrich 608033
Isotec™ L-Lysine-15N2 Sigma-Aldrich 609021
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid Invitrogen 70011044
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich S8820
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific, Inc. 78420
Retsch PM100 Ball Mill Grinder Retsch 20.540.0001
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar Retsch 01.462.0148
Ultramicrospin C18 column The Nest Group SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18 Waters WAT043395
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column Tosoh Corp. 13071 This is the HILIC chromatographic column.
Guard column 4.6 mm ID x1 cm Tosoh Corp. 19021 We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column.
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel Sigma-Aldrich P9740 This is the IMAC resin. Aliquot and store.

References: 脂肪酸定量磷酸化刺激酿酒酵母

  1. Albuquerque, C.P., et al., A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics, 7(7): p. 1389-96 (2008).
  2. McNulty, D.E. and R.S. Annan, Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics, 7(5): p. 971-80 (2008).
  3. Gygi, S.P., et al., Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol, 17(10): p. 994-9 (1999).
  4. Ross, P.L., et al., Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics, 3(12): p. 1154-69 (2004).
  5. Gruhler, A., et al., Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics, 4(3): p. 310-27 (2005).
  6. Wilson-Grady, J.T., J. Villen, and S.P. Gygi, Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res, 7(3): p. 1088-97 (2008).
  7. Villen, J. and S.P. Gygi, The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc, 3(10): p. 1630-8 (2008).
  8. Jensen, S.S. and M.R. Larsen, Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom, 21(22): p. 3635-45 (2007).
  9. Larsen, M.R., et al., Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics, 4(7): p. 873-86 (2005).
  10. Pinkse, M.W., et al., Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem, 76(14): p. 3935-43 (2004).
  11. Tao, W.A., et al., Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods, 2(8): p. 591-8 (2005).
  12. Zhou, H., J.D. Watts, and R. Aebersold, A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol, 19(4): p. 375-8 (2001).
  13. Bodenmiller, B., et al., Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods, 4(3): p. 231-7 (2007).

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1 Comment

Just wondering what was the point of fractionating the peptides as you are enriching them with affinity column

1

Reply

Posted by: NazrulJuly 29, 2010, 1:02 PM

We (and others) have found we get much better coverage of the phosphoproteome when we fractionate and then affinity enrich the phosphopeptides.

1.1

Reply

Posted by: RamseyAugust 2, 2010, 11:51 AM

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