アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

ポストラベリングとBDカルセインAM蛍光色素を用いて測定

彼らがBDマトリゲルマトリックスを介して侵入し、BDフルオロブロックメンブレンを通過した後の細胞を定量にラベルが付いています。その結果、細胞浸潤の唯一のエンドポイントの測定を得ることができる。

1. 〜80％コンフルエントに細胞を成長させる。
2. インサートシステムを準備し、再水和する。
   1. -20℃の保管からパッケージを削除し、それが室温に来ることができます。
   2. 箔のパッケージを開き、挿入井戸の内部に500μL温かい（37℃）のメディアを追加します。プレートは37℃で2時間再水和することを許可° C、5％CO _2を 。
      注 ：これは、細胞遊走のコントロールとして使用されるコーティングされていないBDファルコンフルオロブロック24マルチウェルインサートシステムを再水和するために必要ではない。
   3. 再水和した後、慎重にメンブレン上にBDマトリゲルマトリックスの層を乱すことなく挿入ウェルから培地を取り除く。システムが使用できるようになりました。
3. 細胞単層をトリプシン処理し、5 × 10 ⁴細胞/ mLで無血清DMEMで細胞を再懸濁することにより細胞懸濁液を準備します。
   注 ：異なる細胞タイプを使用している場合に、最適な播種密度を決定する必要があります。多孔質の成長表面上の細胞のタイプに最適な播種密度を決定するために、播種密度の範囲を（細胞/ cm ^2）を使用して、ブラケットの非多孔質表面に使用される播種密度（すなわちフラスコ、ディッシュ、プレート）。たとえば、間に種々の細胞の濃度で2.5 × 10 ⁵細胞/ cm ^2、シードでは、現在シード5 × 10 ⁴と5 × 10 ⁵細胞/ cm ^2、最適な初期播種密度を決定する。
4. 頂端チャンバーに細胞懸濁液の500μL（2.5 × 10 ⁴細胞）を追加します。
5. アクセスのためのサンプルポートを使用して、基底チャンバーのそれぞれに走化性因子の750μL（DMEMで5％FBS）を追加します。
6. BDのアンジオジェネシスの腫瘍浸潤のシステムと非塗工BDファルコンフルオロブロック37℃、5％CO ₂雰囲気で20〜22時間、24マルチウェルインサートプレートをインキュベートする。
7. インキュベーション後、慎重に根尖チャンバーから培地を取り除く。これは、廃棄用容器に内容をフリックすることで実現できます。インサートシステムの底面に触れないでください。
8. 500μL/ウェル、4μg/ mLのカルセインHBSSでAMを含む第二の24ウェルプレートへの挿入システムを転送します。 37℃で1時間インキュベート° C、5％CO _2。それは細胞質エステラーゼにより緑色蛍光カルセインに変換される蛍光性生体染色色素であるため、カルセインAM溶液が蛍光を読み取る前に、下室から削除されません。
9. 浸潤細胞の蛍光は、ボトム読み蛍光プレートリーダーで517分の494 nmの（EX / EM）の波長で読み取られます。ゲイン設定は、経験的に決定する必要があるかもしれませんが、中間点のゲインは十分な出発点でなければなりません。高すぎるゲイン設定は、高い蛍光試料と検出器の飽和につながる可能性がありますが、これは意味のある結果の取得を防ぐことができます。 autogain（あなたの読者にサポートされている場合）の使用は推奨されません。倒立蛍光顕微鏡は、結果を検証するために使用することができますが、この度は、このアッセイを初めて実行した操作を行うために特に便利です。
   注 ：これは、挿入システムが正しいプレートのマップを使用して読み込まれることは重要である。載荷板のマップの詳細についてはwww.bdbiosciences.comまたは接触BDテクニカルサポート（labware@bd.com）でBDの技術告示第436参照してください。プレートをリーダーに挿入されるように適切な板の向きが右に向き左上隅とBD小瓶のロゴでもA1となります。

データの削減

データは次式のように表される。

背景は、パーセントの細胞の浸潤の計算の前に減算されることがあります
RFU =相対蛍光ユニット。

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するBD Biosciences社の従業員です。

1. Sethi, G., Ahn, K.S., Pandey, M.K. & Aggarwal, B.B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-κB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
2. Takada, Y., Kobayashi, Y. & Aggarwal, B.B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
3. Harikumar, K.B., Kunnumakkara, A.B., Ahn, K.S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B.B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. 113:2003-2013 (2009).
4. Nair, A.S., Sishodia S., Ahn, K.S., Kunnumakkara, A.B., Sethi, G., Aggarwal, B.B. Deguelin, an Akt Inhibitor, Suppresses IκBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. 177:5612-5622 (2006).
5. Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. Geneva, Switzerland (http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/Products/pdf/S05B146.pdf)
6. US 6,740,501,B2 , 2004 "An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation" Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M.
7. Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O., "Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds" Mole. Biol. Cell. 12:S 46a (2001).
8. Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference, San Diego, CA (2001).
9. Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening, Edinburgh, SC,UK (1999).

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