The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 107.20.129.212, User IP: 107.20.129.212, User IP Hex: 1796506068
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Üre SAYFA veya üre poliakrilamid jel elektroforezi denatüre ikincil DNA veya RNA yapıları yıkılır ve molekül ağırlığı dayalı bir poliakrilamid jel matris ayrılması için kullanılan 6-8 M üre, istihdam etmektedir. 2 ila 500 üsleri arasında parçaları, bir tek nükleotid gibi küçük uzunluğu farklılıklar, bu yöntemi kullanarak 1 ayrılabilir. Örnek göç seçilen akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır. Poliakrilamid bir daha yüksek oranda düşük molekül ağırlıklı parçaları giderir. Kombinasyonu üre ve sıcaklıklar 45-55 ° C jel çalışması sırasında yapılandırılmamış DNA veya RNA molekülleri birbirinden ayrılması için izin verir.
Genel olarak bu yöntem, tek iplikli DNA veya RNA parçaları, enzimatik parçalanma reaksiyonlarını sentezlenmiş veya etiketli oligonükleotidler veya ürünlerin analiz veya arındırmak için gereklidir.
Bu video makalede denatüre üre poliakrilamid jeller hazırlamak ve çalıştırmak için nasıl göstermektedir. Orijinal protokol 1,2 ek olarak, teknik ipuçları yer almaktadır.
Bu deneysel prosedür için tam ve ayrıntılı bir metin protokol Moleküler Biyoloji Mevcut Protokoller kullanılabilir. Ayrıntılı adım adım talimatlar, jel sandviç montajı için ve jel cihazlar için 3 BioRad web sitesinde bulunabilir.
Gerekli ekipman: Cam levhalar (iç ve dış) 10 cm hücresi: 10,1 x 7,3 cm (iç plaka), 10,1 x 8,2 cm (dış plaka), BioRad 20 cm hücre: 20 x 20 cm (iç plaka), 20 x 22,3 cm (dış plaka), BioRad 0.5-1.5 mm jel tarak ve ayırıcılar Jel döküm standı Kapak ve kablolar ile Jel cihazlar Yüksek gerilim güç kaynağı Isıtma blok veya su banyosu Serolojik pipetler ve Pipet yardım Pipet ve pipet uçları Jel kurutma makinesi veya tarayıcı
Reaktifler ve Çözümleri: Üre (ultra saf) % 40 poliakrilamid çözüm (29:1) 10 x TBE çözeltisi (Tris-borat, EDTA tampon) Deiyonize, distile su TEMED % 30 (w / v) amonyum persülfat çözümü 0,5 x TBE çözüm Formamid EDTA Ksilen cyanol Bromphenol mavi Metanol Etanol
Hacim
50 ml
60 ml
10 ml
Akrilamid konsantrasyonu
% 10
% 12.5
% 15
% 10
% 12.5
% 15
% 10
% 12.5
% 15
g ÜRE
24
24
24
28,8
28,8
28,8
4,8
4,8
4,8
ml% 40 Akrilik (29:1)
12,5
15,625
18,75
15
18,75
22,5
2,5
3,125
3,75
ul 30% APS
166
166
166
199,2
199,2
199,2
33
33
33
ul TEMED
20
20
20
24
24
24
4
4
4
10 x TBE
5
5
5
6
6
6
1
1
1
Hacim deiyonize, distile su ile doldurun
Tablo 1: tek telli oligonükleotidler çözmek için çeşitli akrilamid konsantrasyonları ve hacimleri için gerekli Reaktifler ve çözümler
Jel sandviç montaj ve jel hazırlama
Jel üreticileri açıklamasına göre birleştirin ve jel-döküm haznesi 3 jel düzeltmek. 0.5-1.5 mm kalınlığında ayırıcılar kullanın.
Moleküler biyoloji alanındaki mevcut protokollere göre uygun poliakrilamid çözüm hazırlayın ya da Tablo 1'de listelenmiştir. Denatüre akrilamid jel 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml jel çözüm ve 10.1 x 8.2 cm x 1 mm jel 5 ml jel çözüm için yeterli olacaktır. Birkaç üslerinden aralığında beklenen ürünler / bantlar Büyük jeller kullanılır, daha sonra uzun bir jel tek nükleotid bir fark bantları çözecektir. Beklenen bantları 10'dan fazla nükleotidler farklılık varsa, küçük jeller parçaları çözmek için uygun olacaktır. Ayırma gereksinimlerinin uygun poliakrilamid yüzdesi seçin, daha yüksek bir poliakrilamid konsantrasyonları daha düşük molekül ağırlığı parçaları çözecektir. Ultra saf üre ve istenilen miktarda akrilamid karışımı kullanın. 0.5-1 x TBE nihai bir konsantrasyon ve hacim deiyonize, distile su ile doldurmak için TBE tampon jel karışımı ekleyin. Mikrodalga fırında 20 saniye boyunca çözüm Isı ve hafifçe karıştırın. Çözüm yandan ısınana kadar büyük jel hacimleri için bu adımı tekrarlayın.
Hemen bir serolojik pipet ve iki cam levha arasında otomatik bir pipet yardımı ile jel dökün. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Tarak yerleştirin ve 30-60 dakika süreyle jel polimerize.
Elektroforez cihazı kurmak ve jel prerun
Talimatları 3 üretmektedir göre döküm haznesi ve jel aparat montaj jel ayırın.
Dolgu, cam plakalar, alt olacağını alt tampon odasına zekâ çalışan tampon (0.5-1 x TBE)tamponu ile 2-3 cm birleşti. Tampon çalışan jel top üst tampon odasına kadar doldurun.
Tarak dikkatlice çıkarın ve ipuçları yükleme Bir pipet ve jel kullanarak çalışan tamponu ile kuyu durulayın.
Yüksek gerilim güç kaynağı kabloları jel sistemi ve fiş kapağını takın. Örnekleri yükleyebilirsiniz önce jel ısı ve jel kalan üre kaldırmak için en az 30 dakika boyunca jel prerun var. Optimum sıcaklık 45-55 arasında olmalıdır ° C 60 daha yüksek ° C bantları, yayma veya cam plakalar çatlak olabilir olabilir. Kaçının Prerun (jel başına 15-25 W) için sabit watt seçin.
Örnek hazırlama
Bu arada numunesinin. Bu nedenle, uygun miktarda örnek 2 x jel yükleme karışımı ekleyin. Yükleme karışımı genellikle% 90 formamid,% 0.5 'lik EDTA,% 0.1 ksilen cyanol ve% 0.1 bromphenol mavi içerir.
Örnekleri jel yüklenecek önce, örnekler, örnekleri, birkaç dakika 70-90 ° C arasında ısıtarak ısı denatüre olmalıdır.
Jel yükleme ve çalıştırma
Prerun bittiğinde kapağı kaldırmak ve iyice kuyu içine süzülen üre gibi önce açıklanan cepleri durulayın.
Cebinden alttan örnekleri dikkatle uygulayın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Yükleniyor tampon çalışması sırasında eşit koşulları sağlamak için boş cepleri uygulanacak.
Kapak kurma ve 55 jel sıcaklığını korumak için sabit watt jel çalıştırmak ° C prerun benzer. Jel boya ön alt ucuna ulaşıncaya kadar marker boyaların göç uyun. Çalışma süresi kullanılan akrilamid yüzdesi, tampon ve jel kalınlığı iyonik gücü bağlıdır. Bir çalışma, 2-4 saat arasında sürebilir. Jel sıcaklığını kontrol edin. Bir jel termometre çalışması sırasında sağ sıcaklığını izlemek için yardımcı olabilir.
Jel Süreci
Jel, boya ön jel sonuna ulaştığında alt tampon odasının söndürüldü. Odasından çıkarın ve jel kelepçeler gevşetin. Ayırıcılar dışarı doğru çekin ve dikkatle cam plakalar yüzlülük. Gerekli jel parçası içeren üst kesip durumunda.
Jel, jel fiksasyon solüsyonu (TBE artı% 5-10 Metanol ve Etanol aynı konsantrasyon) dikkatlice ile bir çanak içine aktarın. 5-10 dakika çözüm jel bırakın ve tampon iki kez değiştirin.
Jel, bir vakum jel kurutma makinası ya da doğrudan tarama jel kullanarak daha fazla işlem için hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Grubun keskinlik, çeşitli faktörlere bağlıdır. Yani ideal 1-5 ul arasında keskin bantları için yüklenen örnek hacmi, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Ancak, 15'e kadar ul hala kabul edilebilir bir çözüm sağlar yüklenebilir. Keskin bantları daha az örnek hacmi sonuçları.
Bant kalitesi de jel kalınlığına bağlıdır. 0,75 mm gibi Tiner jeller, 1.5 mm kalınlığında jeller daha iyi sonuçlar göstermektedir.
Bantların şekli de örnek jel cebine eşit uygulanabilir değilse jel yükleme sırasında etkilenmiş olabilir. Yükleme tamponu% 10 gliserol de dahil olmak üzere iyi daha kolay içine jel yükleme ve örnek lavabolar sırasında yardımcı olur.
Beklenen ürün (ler) yükleme boyaların biri olarak aynı düzeyde çalışır örnek yükleme tamponu ile bağlı bir diğer potansiyel sorun oluşabilir. Ayrıca, floresan etiketlerin kullanılması durumunda, bazı boyalar benzer bir dalga boyunda bir floresan sinyal göstermiyor. Eğer bu bir boya veya tüm boyalar kaldırılması durumunda bu sorunu çözebilir. Sonra bir boyut standardı olarak boş bir kuyuda boya içeren örnek çalıştırmak için tavsiye edilir.
Örnek sorunsuz jel ön girer ve yüksek voltaj nedeniyle bu jel cepleri çöküşü önler olarak çalıştırmak başında Alçak gerilim de, keskin bantlar elde etmenize yardımcı olur. Jel istifleme Kısa düşük oranda akrilamid (% 4), aynı bant bilenen etkisi olabilir.
Sık karşılaşılan bir sorun jel elektroforez sırasında jel ile düzensiz ısı dağılımı nedeniyle, "gülümseyerek" dir. Jel tampon ile çevrili değilse, cam plaka, metal plaka bağlama, jel sistemi kullanılmış olduğu bağlı olarak eşit ısı dağılımı destekler ve jel kalitesini önemli ölçüde artırabilir.
Büyük ölçüde çalıştırdıktan sonra jeller yol tutuşunu iyileştiren beri jeller cam plakalar sopa eğilimindedir büyük jelleri için cam plakalar Silanizing, tavsiye edilir.
Denatüre üre poliakrilamid jel elektroforezi (Üre-PAGE) yanı sıra, tek iplikli DNA veya RNA parçaları radionucleotide ya da floresan etiketli örnekleri analiz etmek ya da ayırmak için yararlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14 (17) : 3787-94 (1975).
Albright, L.M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. Appendix 3:Appendix 3B. DOI: 10.1002/0471142700.nca03bs00 (2001).
Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run 20 cm (W) X 25 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.
Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay
1
ReplyPosted by: PradeepkumarNovember 20, 2009, 5:15 AM