Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)

O protocolo de texto completo e detalhado para este procedimento experimental está disponível em protocolos atuais em Biologia Molecular. Detalhadas passo-a-passo as instruções para a montagem do sanduíche de gel e gel para os aparelhos podem ser encontrados no site da BioRad ^3.

Equipamentos necessários:
Placas de vidro (interno e externo)
10 células cm: 10,1 x 7.3 cm (placa interna), 10,1 x 8,2 cm (placa externa), BioRad
20 celulares cm: 20 x 20 cm (placa interna), 20 x 22,3 cm (placa externa), BioRad
0,5-1,5 mm comb gel e espaçadores
Gel ficar fundição
Aparelho de gel com tampa e cabos
Fonte de alimentação de alta tensão
Bloco de aquecimento ou água do banho
Pipetas sorológicas e auxílio de pipeta
Pipeta e Pontas de pipeta
Secador de gel ou scanner

Reagentes e Soluções:
Uréia (ultrapura)
Solução de poliacrilamida 40% (29:1)
10 x TBE solução (Tris-Borato, EDTA buffer)
Água, deionizada
Temed
30% (w / v) de persulfato de amônio
0,5 x solução TBE
Formamida
EDTA
Cyanol xileno
Azul de bromofenol
Metanol
Etanol

Tabela 1: Reagentes e soluções necessárias para as concentrações de acrilamida vários volumes e para resolver único oligonucleotides encalhado

Gel de montagem sanduíche e gel preparação

1. Montar o gel de acordo com a descrição dos fabricantes e corrigir o gel na câmara de gel-casting ^3. Use 0,5-1,5 mm espaçadores de espessura.
2. Prepare a solução de poliacrilamida apropriado de acordo com protocolos atuais em biologia molecular ou como listadas na Tabela 1. Por um gel de acrilamida desnaturante de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solução de gel e por um 10,1 x 8,2 cm x 1 mm gel 5 ml solução de gel é suficiente. Géis maiores são usados ​​quando os produtos esperados / bandas estão dentro da faixa de algumas bases, em seguida, um gel mais irá resolver bandas com uma diferença de um único nucleotídeo. Se as bandas esperados diferem em mais de 10 nucleotídeos, géis menores serão adequados para resolver os fragmentos. Escolha o percentual de poliacrilamida que se adapte às suas necessidades de separação, uma maior concentração de poliacrilamida resolverá menor fragmentos de peso molecular. Use uréia ultrapura e misture com a quantidade desejada de acrilamida. Adicionar tampão TBE à mistura gel para obter uma concentração final de 0,5-1 x TBE e encher o volume com água, deionizada. Aquecer a solução por 20 segundos no microondas e misture delicadamente. Para volumes maiores gel repita este passo até que a solução é a mão quente.
3. Despeje o gel imediatamente, usando uma pipeta sorológica e um auxílio de pipeta automática entre as duas placas de vidro. Evitar a introdução de bolhas de ar. Inserir o Pente e deixar que o gel polimerizar por 30-60 minutos.

Configurar o aparelho de eletroforese e prerun o gel

1. Desmontar o gel da câmara de fundição e montagem para o aparelho de gel de acordo com instruções fabrica ^3.
2. Encha o menor tampão tampão sagacidade câmara de execução (0,5-1 x TBE), que as placas de vidro será subfundiram 2-3 cm com tampão. Encha a câmara superior tampão até o topo do gel com o funcionamento de buffer.
3. Remova cuidadosamente o pente e lavar os poços com tampão de corrida usando uma pipeta e gel loading dicas.
4. Anexar a tampa do sistema de gel e conecte os cabos a uma fonte de alta tensão. Antes que você pode carregar suas amostras que você tem que prerun o gel por pelo menos 30 minutos para aquecer o gel para cima e para remover a uréia remanescente do gel. A temperatura ideal deve estar entre 45-55 ° C. Evite temperaturas superiores a 60 ° C como bandas poderia manchar ou as placas de vidro pode rachar. Escolha watts constante para o prerun (15-25 W por gel).

Preparação de amostras

1. Nesse meio tempo preparar suas amostras. Portanto, adicione a quantidade adequada de mistura de 2 x carregamento gel para sua amostra. A mistura de carregamento geralmente contém formamida 90%, 0,5% EDTA, cyanol 0,1% xileno e 0,1% azul de bromofenol.
2. Antes de as amostras podem ser carregadas no gel, as amostras devem ser de calor desnaturado por aquecimento as amostras entre 70-90 ° C por alguns minutos.

Carregar e executar o gel

1. Quando o prerun terminar, retire a tampa e lave bem os bolsos, como descrito antes, como uréia tem lixiviado para os poços.
2. Aplicar as amostras cuidadosamente do fundo do bolso. Evitar a introdução de bolhas de ar. Tampão de carregamento tem de ser aplicado para os bolsos vazios para manter a igualdade de condições durante a corrida.
3. Montar a tampa e executar o gel em watts constante para manter a temperatura do gel de 55 ° C semelhante ao prerun. Observar a migração dos corantes do marcador até que a frente de corante atingiu a extremidade inferior do gel. A duração da execução depende da porcentagem de acrilamida usado, força iônica do tampão e espessura gel. A execução pode durar entre 2-4 horas.
   Verificar a temperatura do gel. Um termômetro gel podem ajudar a monitorar a temperatura adequada durante a corrida.

Processar o gel

1. Quando a frente do corante atingiu o final do gel colocar o gel para fora da câmara inferior buffer. Remova o gel da câmara e soltar os grampos. Afaste os espaçadores e cuidadosamente dissimular as placas de vidro. Se for necessário cortar a parte superior bem contendo parte gel.
2. Transferir cuidadosamente o gel em um prato com uma solução de gel de fixação (mesma concentração de TBE além de metanol e etanol 5-10%). Deixe o gel na solução por 5-10 minutos e mudar o buffer duas vezes.
3. O gel está pronto para posterior processamento usando um secador de gel vácuo ou digitalização direta do gel.

1. A nitidez da banda depende de vários fatores. O volume da amostra carregada para as bandas nítidas deve ser o menor possível, isto é, idealmente entre 1-5 mL. No entanto, até 15 mL podem ser carregados que ainda garante uma resolução aceitável. Resultados menos amostra de volume em faixas mais nítidas.
2. A qualidade da banda é também dependente da espessura do gel. Géis mais finas, como 0,75 milímetro mostram melhores resultados do que 1,5 milímetros de espessura géis.
3. A forma de bandas também pode ser influenciado durante o carregamento gel, se a amostra não é aplicada igualmente para o bolso gel. Incluindo glicerol 10% no tampão de carregamento ajuda durante o carregamento do gel e os dissipadores de amostra no poço com mais facilidade.
4. Outro problema potencial que está conectado com o tampão de carregamento de amostra pode ocorrer, se o produto esperado (s) é executado no mesmo nível como um dos corantes carregamento. Além disso, se etiquetas fluorescentes são utilizados, alguns corantes mostram um sinal fluorescente no comprimento de onda similar. Se este for o caso a remoção de um corante ou todos os corantes podem resolver este problema. Então, é aconselhável executar o exemplo de corantes contendo, em um poço vazio como um padrão de tamanho.
5. De baixa tensão no início da corrida também ajuda a obter bandas mais nítidas, como a amostra entra na frente gel suave e evita que o gel bolsos colapso devido à alta tensão. A acrilamida baixa porcentagem pequena de empilhamento gel (4%) pode ter o efeito de banda nitidez mesmo.
6. Um problema freqüentemente encontrado é gel "sorrindo", que é devido à distribuição desigual de calor através do gel durante a eletroforese. Se o gel não é cercado por buffer, dependendo de qual sistema de gel é empregado, anexando de uma placa de metal para a placa de vidro suporta uma distribuição de calor igual e pode aumentar substancialmente a qualidade gel.
7. Silanizing de placas de vidro para géis maiores é aconselhável, uma vez que melhora a manipulação de géis após a corrida, como géis tendem a se ater às placas de vidro.

Desnaturação uréia eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE-uréia) é útil para analisar ou separados single-stranded DNA ou fragmentos de RNA, bem como amostras de radionuclídeos ou fluorescente etiquetados.