Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

1. Işlemine başlamadan önce, aşağıdaki öğeleri toplanmış ve hazırlanmış olması gerekir:
   • Buz
   • 27g iÄŸne ile 5ml şırınga
   • 25g iÄŸne ile 5ml şırınga
   • Strafor blok ve fare montaj pimleri
   • Montaj bloÄŸu yerleÅŸtirilmiÅŸ olabilir Tepsi
   • Makas ve forseps
   • Toplama tüpleri
   • % 70 etanol
   • PBS ile% 3 fetal buzağı serumu (FCS) (Ön buz üzerinde soÄŸutulmuÅŸ ve muhafaza)
2. Fare Euthanize,% 70 etanol ile sprey ve sırtında strafor blok üzerine monte edin.
3. Bir makas ve forseps kullanarak periton dış deri kesme ve periton boşluğuna kaplayan iç deri hafifçe ortaya çıkarmak için geri çekin.
4. 27g bir iğne kullanılarak peritoneal kavite içine buz PBS (% 3 FCS) 5 ml enjekte edilir. Herhangi bir organ dikkatli olmazsanız ponksiyon için periton iğne yavaşça itin.
5. Enjeksiyondan sonra, periton PBS çözümü herhangi bir bağlı hücreleri çıkarmak için hafifçe masaj yapın.
6. Periton bir 5 ml şırınga bağlı olarak, 25 g iğne, konik takın ve sıvı yağ dokusu veya diğer organlar tarafından tıkanmasını önlemek için iğne ucu hafifçe hareket ettirerek toplamak. Mümkün olduğunca fazla sıvı olarak toplayın ve şırınga iğnesi çıkardıktan sonra buz üzerinde tutulmalıdır tüplerde toplanan hücre süspansiyonu yatırmak.
   İsteğe Bağlı: Tekrar adım 4-6
7. Periton iç deride bir kesi yapın ve bir forseps ile cilt tutarken boşluğunda kalan sıvı toplamak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
8. 6 ya da 7 adımda görünür kan kontaminasyonu tespit edilirse kontamine örnek atılmalıdır.
9. 1500 RPM, 8 dakika boyunca toplanan hücre süspansiyonu Spin süpernatantı atmak ve istenen ortam veya PBS içinde hücre sayımı için tekrar süspansiyon haline getirin.

Tiyoglikolat elde Alternatif protokol makrofajlar ortaya çıkardı:

Bu yöntem, makrofajların daha yüksek verim elde etmek için kullanılır.

1. % 3 (w / v) her fare periton boÅŸluÄŸuna Brewer tiyoglikolat orta (7) 5 ml enjekte edilir.
2. 3-5 gün bekleyin ve hücrelerin toplanması için yukarıdaki 1. adımı geçin.

Nonelicited yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, yaklaşık 10 kat daha fazla makrofaj toplanabilir. Tek endişe, bu yordamı ile elde edilen makrofajlar bazı fizyolojik özellikleri farklı olduğunu.

Temsilcisi sonuçları:

Unmanipulated fare, 5-10 milyon periton boşluğuna hücreleri iyi bir izolasyon protokolü ile elde edilebilir. Tüm canlı hücreler arasında,% 50-60 B hücreleri, ~% 30 makrofajlar ve T hücreleri (Şekil 1)% 5-10.

Şekil 1. Periton boşluğuna izole hücre fenotipi periton boşluğuna hücreleri takiben izolasyonu ile boyandı anti-fare TCRβ FITC, B220-PE-Texas kırmızı, CD11b-Pasifik mavi, CD23-PE-Cy7 ve CD5-APC. Temsilci akış sitometrik araziler, B ve T hücreleri (a), makrofajlar (b), B1 ve B2 hücreleri (c) ve B1a ve B1b hücreleri (d) yüzdeleri göstermektedir.

Periton boÅŸluÄŸuna hücrelerinin izolasyonu, farklı bağışıklık hücreleri, baÅŸta makrofajlar ve spesifik B hücre alt çalışma için önemli bir tekniktir. Bu basit bir süreç olmasına raÄŸmen, bazı kritik adımlar vardır. Saf bir periton boÅŸluÄŸuna hücre popülasyonu elde etmek için toplanan örnek kan kirlenmesine varlığı kaçınılmalıdır. Servikal dislokasyon tarafından Ötenazi periton boÅŸluÄŸunda kan kirlenmesini önlemek için dikkatli bir ÅŸekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak CO ₂ kullanılabilir. Buna ek olarak, prosedüre uygun bakım sırasında peritoneal kavite, mesane ya da herhangi bir diÄŸer organlara delinmesiyle önlemek için alınmalıdır. Enjekte edilen sıvı en kurtarma, hücre verimi önemlidir.

Bu prosedürü, yaygın olarak orta numaraları bu yana ikamet eden makrofaj biyoloji okumak için kullanılır, unstimulated makrofajlar kolayca makrofaj koloni stimüle edici faktör (8 kullanılarak, in vitro olgun makrofajlara miyeloid progenitör hücrelerin ayırt zahmetli görev aksine, periton boşluğuna elde edilebilir , 9). Tiyoglikolat kullanımı makrofajlar (7) fizyolojik özelliklerini değiştirebilir olsa da periton boşluğunda makrofaj verim, tiyoglikolat ortaya çıkarma yöntemi kullanarak geliştirilebilir.

B hücreleri bağışıklık sisteminin doğal ve adaptif bağışıklık hem de önemli rol oynayan önemli bir parçasıdır. Farklı B hücre alt arasında, B1 hücreleri B hücreleri doğuştan gelen bağışıklık, otoimmünite ve bağışıklık düzenleme yer eşsiz bir alt oluşmaktadır. B1 hücreler öncelikle periton boşluğunda bulunan ve kendini yeniler. Onlar, ilk satırı, bir virüs sayısı ve bakteriler (10-12) karşı koruma sağlar doğal IgM birincil üreticiler biri. B1 hücreler de immün regülasyon yer alan önemli bir sitokin olan IL-10 (6), önemli bir kaynağıdır. B1 hücreleri ile çeşitli çalışmalar takip olmasına rağmen, hala özel, kendi karşıt fonksiyonları daha fazla değerlendirme için düzenleyici rol kapsamı vardır. Periton boşluğuna hücre izolasyon yöntemi B1 hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor.

Bu çalışma NIH hibe AI069358 ve BloodCenter Araştırma Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Zhang, X., Goncalves, R. and Mosser, D.M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology (2008).
2. Boes, M., Prodeus, A.P., Schmidt, T., Carroll, M.C. and Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
3. Mc Daniel, L.S., Benjamin, W.H., Forman, C. and Briles, D.E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
4. Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L.D. and Rajan, T.V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
5. Mercolino, T.J., Arnold, L.W., Hawkins, L.A. and Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
6. O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G. and Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol.  22, 711-717 (1992).
7. Hoover, D.L. and Nacy, C.A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
8. Austin, P.E., McCulloch, E.A. and Till, J.E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
9. Stanley, E.R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
10. Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O.C., Jager, G.C. and Herzenberg, L.A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
11. Baumgarth, N., Herman, O.C., Jager, G.C., Brown, L.E., Herzenberg, L.A. and Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
12. Berland, R. and Wortis, H.H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).

29 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.