Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

1. Antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados:
   • Gelo
   • Seringa de 5 ml com agulha 27g
   • Seringa de 5 ml com agulha 25g
   • Bloco de isopor e pinos para a montagem do rato
   • Bandeja em que o bloco de montagem pode ser colocado
   • Tesouras e pinças
   • Tubos de coleta
   • Etanol 70%
   • PBS com 3% de soro fetal bovino (FCS) (Pré-refrigerado e mantido em gelo)
2. Euthanize o mouse, pulverizá-lo com etanol 70% e montá-la no bloco de isopor em sua parte traseira.
3. Usando uma tesoura e uma pinça cortar a pele externa do peritônio e puxe-o de volta para expor a pele interna que reveste a cavidade peritoneal.
4. Injectar 5 ml de PBS gelado (com FCS 3%) na cavidade peritoneal, utilizando uma agulha 27G. Empurre a agulha devagar no peritônio tomando cuidado para não perfurar nenhum órgão.
5. Após a injeção, massagear suavemente o peritônio para desalojar quaisquer células anexado na solução PBS.
6. Inserir uma agulha de 25 g de bisel, para cima, ligada a uma seringa de 5 ml no peritônio e recolher o líquido enquanto se move a ponta da agulha com cuidado para evitar o entupimento pelo tecido adiposo ou outros órgãos. Recolher o líquido tanto quanto possível, e depositar a suspensão de células coletadas em tubos mantidos em gelo depois de retirar a agulha da seringa.
   Opcional: Repita o passo 4-6
7. Faça uma incisão na pele interna do peritônio e, mantendo a pele com uma pinça use um plástico Pasteur pipeta para coletar o líquido restante da cavidade.
8. Se no passo 6 ou 7 de contaminação por sangue visível é detectada em seguida, a amostra contaminada deve ser descartada.
9. Gire a suspensão de células coletadas em 1500 RPM por 8 minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meios de comunicação desejado ou PBS para contagem.

Protocolo alternativo para a obtenção tioglicolato provocou macrófagos:

Este método é usado para obter um maior rendimento dos macrófagos.

1. Injectar 5 ml de 3% (w / v) Brewer tioglicolato médio (7) na cavidade peritoneal de cada rato.
2. Aguarde 3-5 dias, e avance para o passo 1 acima para a recolha das células.

Comparação com a abordagem nonelicited, aproximadamente 10 vezes mais macrófagos podem ser coletados. A única preocupação é que os macrófagos obtidos por este procedimento diferem em algumas de suas propriedades fisiológicas.

Resultados representativos:

De um mouse não-manipulado, 5-10 milhões de células da cavidade peritoneal pode ser obtida com um protocolo de um bom isolamento. Entre todas as células vivas, 50-60% são células B, macrófagos ~ 30% e 5-10% são células T (Fig. 1).

Figura 1. Fenótipo de células isoladas da cavidade peritoneal. Após o isolamento de células cavidade peritoneal foram corados com anti-rato TCRβ-FITC, B220-PE-Texas vermelho, azul-Pacífico CD11b, CD23-PE-Cy7 e CD5-APC. Parcelas fluxo representante citometria mostram porcentagens de células B e T (a), macrófagos (b), B1 e B2 células (c) e células B1a e B1b (d).

Isolamento de células da cavidade peritoneal é uma técnica importante para o estudo das diferentes células do sistema imunológico, principalmente macrófagos e subpopulações de células B específicas. Embora este seja um processo simples, existem alguns passos críticos envolvidos. Presença de contaminação de sangue na amostra coletada deve ser evitada para obter uma população de células pura peritoneal da cavidade. Eutanásia por deslocamento cervical deve ser feito com cuidado para evitar a contaminação de sangue na cavidade peritoneal. Alternativamente CO ₂ pode ser usado. Além disso, durante o procedimento adequado de cuidados devem ser tomados para evitar a perfuração da bexiga ou quaisquer outros órgãos na cavidade peritoneal. Recuperar a maior parte do fluido injetado é também importante para o rendimento das células.

Este procedimento é amplamente utilizado para estudar a biologia dos macrófagos desde números moderados de residentes, macrófagos unstimulated pode ser facilmente obtida a partir da cavidade peritoneal, em contraste com a laboriosa tarefa de diferenciar as células progenitoras mielóides em macrófagos maduros in vitro, usando fator estimulador de colônias de macrófagos (8 , 9). O rendimento de macrófagos da cavidade peritoneal pode ser melhorada usando o método de elicitação de tioglicolato, embora o uso tioglicolato pode alterar as propriedades fisiológicas dos macrófagos (7).

Células B são uma parte importante do nosso sistema imunológico jogar um papel crucial em ambos os imunidade inata e adaptativa. Em subpopulações de células diferentes B, células B1 compõem um único subconjunto de células B envolvidos na imunidade inata, auto-imunidade e regulação imune. Células B1 estão localizados principalmente na cavidade peritoneal e estão reabastecendo self. Eles são uma das principais produtoras de IgM natural que fornece a primeira linha de defesa contra uma série de vírus e bactérias (10-12). Células B1 também são uma importante fonte de IL-10 (6), que é uma importante citocina envolvida na regulação imune. Embora vários estudos tenham sido prosseguida com as células B1, ainda há espaço para uma avaliação mais aprofundada das suas funções contrastantes, especialmente o seu papel regulador. Peritoneal cavidade método de isolamento de células proporciona a oportunidade única de estudar as funções das células B1.

Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder AI069358 ea Fundação de Pesquisas BloodCenter.

1. Zhang, X., Goncalves, R. and Mosser, D.M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology (2008).
2. Boes, M., Prodeus, A.P., Schmidt, T., Carroll, M.C. and Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
3. Mc Daniel, L.S., Benjamin, W.H., Forman, C. and Briles, D.E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
4. Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L.D. and Rajan, T.V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
5. Mercolino, T.J., Arnold, L.W., Hawkins, L.A. and Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
6. O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G. and Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol.  22, 711-717 (1992).
7. Hoover, D.L. and Nacy, C.A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
8. Austin, P.E., McCulloch, E.A. and Till, J.E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
9. Stanley, E.R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
10. Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O.C., Jager, G.C. and Herzenberg, L.A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
11. Baumgarth, N., Herman, O.C., Jager, G.C., Brown, L.E., Herzenberg, L.A. and Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
12. Berland, R. and Wortis, H.H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).

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