为介观荧光体层摄影术在体内成像的发展果蝇

Claudio Vinegoni¹, Daniel Razansky², Chrysoula Pitsouli³, Norbert Perrimon³, Vasilis Ntziachristos², Ralph Weissleder¹

¹Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, ²Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Technical University of Munich and Helmholtz Center Munich, ³Department of Genetics, Harvard Medical School and Howard Hughes Medical Institute

果蝇在本实验中使用的股票有以下几种：

• elav GAL4（FBti0002575）
• AP - Gal4md544（FBal0051787）
• 无人机srcEGFP（FBti0013990）
• w1118（FBal0018186）

所有实验的UAS - GAL4系统是用于高表达绿色荧光蛋白在利益的组织（即唾液腺或机翼光盘）。更具体地说，与适当的Gal4的转基因的雌性果蝇杂交UAS - EGFP转基因队友。十字架被饲养在25 ° C，在培养箱。当蛹开始填充瓶（约5-6天，后交叉），他们选择了绿色荧光的白色prepupal阶段puparium形成后（0-1小时）和断层成像收集。

1. 设置适当的十字架和后方，在25 ° C
2. 5-6天后开始交叉，选择荧光成像的后代。使用湿画笔轻柔去除白色小瓶双方prepupae。
3. 将水或PBS下降prepupae放置在培养皿中，去除食物颗粒和胶水，涵盖了蛹的情况下，使试样autofluorescent。轻轻地用画笔干净。如果蛹的老龄化是必要的，地点选定在培养皿用湿纸巾（湿热试验箱），或在飞的食物与干净的小瓶双方白色prepupae。这将确保有足够的湿度，使动物的正常发展。

果蝇安装

1. 胶底部蛹成毛细玻璃管（直径800微米）的情况下，果蝇的前/后的轴方向平行管。
2. 修复毛细管垂直旋转舞台上。
3. 调整为旋转轴平行的成像CCD的像素列的倾斜轴旋转舞台。

测定转发模型

1. 固定在玻璃毛细管蛹和装入如前所述
2. 用荧光染料（Cy5.5），填写一个石英毛细管（100微米，外径）
3. 在45度插入毛细管蛹内与前/后轴
4. 低数值孔径镜头激发激光束照射的蛹。收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的荧光透射图像。
5. 适合与一个适当的前瞻性模型实验数据

涎腺成像

1. 安装在前面所述的唾液腺蛹表达GFP
2. 激发光照亮和透收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的绿色荧光信号。
3. 重建采集到的数据，利用正向模型

时移成像

1. 安装在机翼成虫光盘白色prepupa表达GFP
2. 保持成像环境潮湿，并在室温下，以避免脱水蛹。
3. 放置一个快门，以避免连续照明
4. 激发光照亮和透收集超过360度，沿垂直轴旋转的蛹的绿色荧光信号。
5. 利用远期模型重建所取得的数据。

组织学

1. 解剖唾液腺CNS 1X PBS /眼光盘。
2. 在4％甲醛，1个质子交换膜（100mm的管道，为1mM EGTA，1MM氯化镁_2）在室温下20分钟的修复组织。
3. 取出固定在Vectashield用DAPI（矢量）和挂载
4. 用荧光显微镜下的图像。

时间的推移组织学

1. 收集白色prepupae和他们在湿热试验箱阶段。
2. 收集在不同发育阶段的蛹
3. 扎蛹的情况下，两次（0小时后Puparium形成），用细针（昆虫针000，FST）的前固定。
4. 固定在8％的甲醛，1个质子交换膜在室温下6-8小时，轻轻摇动的蛹。
5. 后拆除固定和1X PBS漂洗，切用锋利的刀片在两块固定的蛹垂直的A / P轴;
6. 浸Vectashield的两件用DAPI（矢量）和mount玻璃罩幻灯片成像（实验室TEK）。
7. 用荧光共聚焦显微镜采集图像。

图1，请点击这里见人图1 arger版本。