Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

, , ,

Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.252.150, User IP: 23.22.252.150, User IP Hex: 387382422

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Campos, P. B., Sartore, R. C., Abdalla, S. N., Rehen, S. K. Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping. J. Vis. Exp. (31), e1512, doi:10.3791/1512 (2009).

Abstract: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

وإن كانت قد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) لتقديم النمط النووي ضعفاني مستقرة 1 ، وأفادت دراسات عديدة بأن تبعا للظروف الثقافة التي تصبح عرضة لاكتساب شذوذ الكروموسومات مثل إضافة أو أجزاء كاملة من الكروموزومات. في الواقع ، خلال فترة طويلة الأجل والثقافة ، ولوحظت تغييرات karyotypic عندما تستخدم الأنزيمية أو التفكك الكيميائي 2،3،4 ، في حين تشريح دليل المستعمرات الركض ليحتفظ النمط النووي مستقرة 5. الى جانب ذلك ، التغيرات في البيئة ، مثل ازالة الخلايا المغذية ويبدو أيضا أن تعرض للخطر سلامة الجيني للhESC 3،6. مرة واحدة يمكن أن تؤثر التغيرات الكروموسومية الفيزيولوجيا الخلوية ، وتوصيف سلامة الجيني للhESC في المختبر أمر حاسم hESC النظر بوصفه أداة أساسية في الدراسات والاختبارات تخلق المخدرات. علاوة على ذلك ، لأغراض علاجية في المستقبل التغيرات الكروموسومية هي مصدر قلق حقيقي ويرتبط في كثير من الأحيان إلى التسرطن.

هنا نعرض طريقة بسيطة ومفيدة للحصول على ارتفاع هوامش كروموسوم الجودة للتحليل اللاحق للكروموسوم التي وضعتها مجموعة النطاقات ، SKY ، FISH أو تقنيات CGH 7،8. نوصي بالتحقق من الوضع الكروموسومات بشكل روتيني مع فترات من 5 فقرات من أجل رصد ظهور translocations و[أنيوبلويدي]

ساهم Priscila بريتو وSartore رافاييلا بالتساوي على الورق.

Protocol: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

EQUIPMENT

  • نسيج الثقافة حاضنة و 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2
  • الطرد المركزي
  • مجموعة من micropipettors (100 ، 100μL)
  • حمام المياه 37 درجة مئوية
  • حمام المياه 90 درجة مئوية لتكون مصدرا لبخار الماء
  • المرحلة النقيض المجهر

الخطوة الأولى

علاج الخلايا مع colcemid

في هذا الإجراء استخدمنا خط hESC H9 مثقف على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF) المعطل مع C mitomycin (سيغما) والاحتفاظ بها في DMEM/F12 (Invitrogen) تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل (KSR ، Gibco) و8ng/mL من عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل - 2 ، R & D).

من أجل الحصول على عدد كبير من انتشار metaphases ، فمن المستحسن استخدام الثقافات مع مؤشر الإنقسامية العالية التي توجد فيها العديد من الخلايا المنقسمة.

  1. تأخذ قارورة الثقافة من الحاضنة ، وتدفق الصفحي ، إضافة Colcemid بتركيز نهائي من 0،1 ميكروغرام / مل.
  2. عودة القارورة إلى حاضنة وانتظر 3 ساعات حتى يمكن أن يسبب المانع القبض على الإنقسامية الطورية ، عندما يتم مكثف جيدا الكروموسومات ويمكن تصور بسهولة تحت المجهر.

تحديد الخلايا

  1. إخراج المتوسطة وإضافة tripsin / EDTA 0.05 ٪ تكفي لتغطية سطح الخلايا. السماح لاحتضان خلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم تعطيل انزيم إما عن طريق إضافة مستنبت يحتوي المصل أو بإضافة فقط المصل إلى الخلايا.
    ملاحظة : من المهم للتأكد من أن يتم التوصل إلى وقف للحصول على خلية واحدة ينتشر الطورية جيدة.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل و 122 جهاز طرد مركزي في غرام لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل طاف ، وترك حوالي 200 مل ، وresuspend الكرية بلطف من خلال الاستفادة من الأنبوب ، كما هو مبين في الفيديو. تأكد من أن الخلايا تنفصل بشكل جيد ، بحيث لا يمكن تصور أي كتل في الحل.
  4. القادم سوف تحتاج إلى إضافة 5 مل من محلول ناقص التوتر (بوكل 75mM) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية ، وببطء ، من قبل جدار الأنبوب كما في الوصف التالي. أولا إضافة 3 مل ، عكس الأنبوب إلى وضع أفقي تماما لمزج الخلايا التي تحتوي على حل ناقص التوتر ثم إضافة ما تبقى من 2 مل والدفء في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية.
    ملاحظة : عند هذه النقطة الحل ناقص التوتر وسوف يسبب زيادة في حجم الخلايا وتساعد على استجلاء الكروموسومات. الوقت من المهم الحضانة للحصول على كروموسوم ينتشر جيدة. إذا كان توقيت طويل جدا ، قد انفجر غشاء الخلية مبكرا وتفقد الكروموسومات. إذا كان قصيرا جدا ، قد يكون من الصعب الحصول على كروموسوم ينتشر لأن غشاء الخلية قد لا تخريبها.
  5. إضافة 3 قطرات من محلول تثبيتي (الميثانول / حامض الخليك الجليدي 3:1) ، قلب الأنبوب برفق لمزج الحل تثبيتي مع خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 122 غ لمدة 5 دقائق من دون انقطاع.
    ملاحظة : يجب أن يكون الحل تثبيتي الطازجة.
    ملاحظة : من المهم استخدام الطرد المركزي من دون انقطاع لتجنب استنزاف الخلايا ، ومنع فقدان المادة.
  6. تجاهل طاف ، وترك حوالي 200 مل ، وresuspend الكرية بلطف التنصت على الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة : مرة أخرى ، تأكد من أن الخلايا تنفصل بشكل جيد ، بحيث لا يمكن تصور أي كتل في الحل.
  7. إضافة أول 3 مل من محلول تثبيتي ، ببطء عن طريق أنبوب الجدار ، بينما تقوم بتدوير الأنبوب. عكس الأنبوب إلى وضع أفقي لمجرد مزج الخلايا ، ومن ثم إضافة المزيد 2 مل من محلول مثبت بواسطة الجدار أنبوب لتأخذ الخلايا إلى أسفل. الأسهم عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    ملاحظة : يمكن تخزين هذه الخلايا في محلول مثبت ثابت لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. إلى جانب حماية الخلايا في دولتهم متورمة ، والحل تثبيتي ، يزيل الدهون والبروتينات يبدل طبيعة. هذه الأحداث تجعل من غشاء الخلية الهشة ، ونتيجة لذلك ، جعل كروموسوم ينتشر بسهولة.

تنظيف الشرائح الزجاجية

قبل البدء في اتخاذ ينتشر كروموسوم الخاص تأكد من أن يتم تنظيفها بشكل صحيح الشرائح أو قد تفقد بعض النوى وكذلك metaphases. هذه الخطوة بأنها مهمة بشكل جيد إذا كنت تريد أن تجرب أي أسلوب التهجين 9.

  1. مكان الشرائح في دورق يحتوي على حمض الهيدروكلوريك 6M مدة لا تقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  2. بعد هذا الوقت ، وتغسل الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 10 دقيقة.
  3. شطف الشرائح في الماء المقطر ، واسمحوا أن تجف في درجة حرارة الغرفة.
  4. ويمكن الآن أن يتم تخزين الشرائح في الايثانول 96 ٪ والمجففة مع مباشرة قبل خالية من الوبر للاستخدام.

ملاحظة : للحصول على طرق التهجين الموضع ، لا يمكن أن يتم تخزين الشرائح لأكثر من 2 في أيام الإيثانول 96 ٪

الخطوة الثانية

غسل الخلايا

  1. في اليوم التالي ، الطرد المركزي الخلايا في 122 غ لمدة 5 دقائق من دون انقطاع.
  2. Dوطاف iscard ترك حوالي 200 مل. Resuspend الكرية بواسطة أنبوب عبها بلطف ثم يضاف 5 مل من محلول مثبت الطازجة (الميثانول / حامض الخليك الجليدي 3:1) ، وببطء من الجدار في حين تناوب أنبوب الأنبوب. كرر هذه الخطوة 2 غسل أكثر من مرة عن ما مجموعه ثلاثة يغسل.
    ملاحظة : يجب أن يكون الحل تثبيتي الطازجة.

اعداد الشرائح

  1. في خطوة الطرد المركزي الماضي ترك كمية كافية من حل لتجانس بيليه الخلية والحصول على كثافة كافية من الخلايا في الشرائح (انظر الشكل 1).
  2. إضافة 20-30 ميكرولتر من التعليق على شريحة خلية جافة ونظيفة عن طريق تحريك ماصة قريبة جدا وموازية لسطح الأرض. كما يتبخر الحل مثبت ، سطح الشريحة تصبح مشوشة.
  3. على الفور ، وتعريض الشريحة ، مواجهة ، في بخار الماء الساخن (90 درجة) لمدة 30 ثانية لتسبب خلايا تفجير.
    ملاحظة : في هذه اللحظة ، والميثانول من يتبخر الحل تثبيتي ، مما أدى إلى زيادة تركيز حامض الخليك ، والتي جنبا إلى جنب مع المياه يحفز كروموسوم الانتشار.
  4. نظرة على النقيض من المرحلة المجهر فقط لمعرفة ما اذا كان التركيز فضلا عن توزيع الخلية السليمة (انظر الشكل 1).
  5. الآن الشرائح جاهزة لاستخدامها للتحقق من مجموعة من الكروموزومات التي مناهج علم الوراثة الخلوية كما G - النطاقات (بالغيمزا) ، السماء ، أو CGH السمكية.

IMPORTANT تلوح

كيفية اختيار الطورية كافية لتحليلها

اختيار metaphases مستديرة ومعزولة (الشكل 2D) ، قد تجنب النظر [أنيوبلويدي] كاذبة عن المكسب من الكروموزومات التي تم إنشاؤها بواسطة اثنين أو أكثر ينتشر مختلطة مع بعضها البعض أو الخسارة من الكروموزومات التي تم إنشاؤها بواسطة كروموسوم إطلاقها. هكذا ، وتجنب اختيار metaphases قرب نوى لأن قد تكون مخفية بعض الكروموسومات بها (الشكل 2A و 2B). الى جانب ذلك ، نبحث عن metaphases المستديرة والتأكد من أن يتم فصل أي كروموسوم من الطورية (الشكل 2C).

الخلايا المغذية والنمط النووي hESC

G - لربط وتحليل SKY ، فإن وجود الخلايا المغذية في الثقافة hESC لا تتداخل مع النتائج ، وذلك لأن الخلايا المغذية ليست في ظل حالة الانقسام (المعطل بواسطة C mitomycin أو التشعيع) ، وسوف لا تكون جزءا من السكان الطورية. ومع ذلك ، لتطبيق تقنية FISH في نواة الطور البيني ، ويفضل أن تفصل بين السكان من الخلايا المغذية hESC عن طريق حصاد المستعمرات يدويا قبل trypsinization للتحليل السمكية.

الشكل 1
الشكل 1 : كيف تعرف كثافة الخلية المناسبة في الشرائح. صور المجهر النقيض من المرحلة في الهدف 10X. (A) وكثافة الخلايا عالية جدا. الأسهم تشير إلى الطورية ينتشر قريبة جدا من النوى. (ب) مع شريحة كثافة خلية جيدة. الدوائر تظهر metaphases ينتشر المعزولة من نوى أو metaphases الأخرى. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

الشكل 2
الشكل 2 : كيفية اختيار الطورية كافية لتحليلها. هي ملطخة الكروموسومات مع دابي والصور التي حصلت عليها المجهر الفلورسنت في الهدف 100X. (أ) (ب) تجنب metaphases قرب نوى (المشار إليها بواسطة الأسهم) (C) وليس metaphases الجولة الحالية التي تفصل الصبغيات (دائرة). (د) الطورية الجولة هو الطورية جيدة ليتم تحليلها. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

إعداد ينتشر الكروموسومات هي خطوة حاسمة لإجراء تحليل لحالة نجاح الوراثية للخلايا الجذعية الجنينية من خلال تقنيات روتينية كما G - النطاقات ، وتقنيات أكثر تطورا مثل الأسماك والسماء وCGH.

ويمكن تطبيق هذا الإجراء لأنواع مختلفة العديد من الخلايا في فترة الحضانة colcemid ، الذي يعتمد على طول دورة الخلية. لمستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية ، ونحن ننتظر 3 ساعات بينما لهيئات مضغي الشكل (EB) هذه المرة يمكن ان تصل الى 6 ساعات.

في حالة العمل مع المجاميع الخلية (مثل الهيئات مضغي الشكل) سوف تحتاج إلى فصل بشكل جيد للغاية من أجل الحصول على حل خلية واحدة. في هذه الحالة ، بعد تفكك التربسين والميكانيكية ، ويمكنك الاستفادة من مصفاة النايلون الخلية 40μm دينار بحريني (العلوم البيولوجية) ومن ثم إعطاء تسلسل لإجراء (من الخطوة 4 من موضوع الإجراءات).

في الإجراء وصفها هنا تجدر الإشارة إلى أن يتم إسقاط نظام التعليق الخلية "عن كثب" على الشرائح من أجل تجنب الإفراط في انتشار الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي جيل من القطع الأثرية.

ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول هو أداة مفيدة وبسيطة ليتم تطبيقها بشكل روتيني ليس فقط من قبل مختبرات التعامل مع الخلايا الجذعية الجنينية لكن المحققين الآخرين المهتمين بدراسة عدم الاستقرار الكروموسومات في الخلايا الجذعية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Materials: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Techno Plastic Products 91015
Colcemid Karyo MAX GIBCO, by Life Technologies 15212-012
EDTA Isofar 721
Glacial acetic acid Isofar 100
Methanol Isofar 208
Potassium Chloride (KCl) Merck & Co., Inc. 104.931.000
Slide Bioslide 7105-1
Tripsin Sigma-Aldrich T4799

References: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

  1. Thomson, J. A. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 (5391), 1145 (1998).
  2. Draper, J. S. et al., Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 22 (1), 53 (2004).
  3. Maitra, A. et al., Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet 37 (10), 1099 (2005).
  4. Mitalipova, M. M. et al., Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23 (1), 19 (2005).
  5. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., and Colman, A., Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol 22 (4), 381 (2004); Caisander, G. et al., Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res 14 (2), 131 (2006).
  6. Imreh, M. P. et al., In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem 99 (2), 508 (2006).
  7. Robin-Wesselschmidt, Jeanne Loring;, in Human Stem Cell Manual, edited by Jeanne F Loring; Robin L Wesselschmidt and Philip H Schwartz (Elsevier's Science & Technology Rights, California), pp. 59 (2007).
  8. Rooney, D. E., Human Cytogenetics, Third Edition ed. (Oxford University Press, 2001).
  9. Heslop-Harrison, Trude Schwarzacher;, in Practical in situ hybridization, edited by Trude Schwarzacher and Heslop-Harrison (BIOS Scientific Publishers, Oxford), pp. 51 (2000).

Ask the Author: الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

4 Comments

The procedure seems easy enough, but how do you analyze the chromosomes? We don't have any experience.
Thank-you

1

Reply

Posted by: R. CottermanNovember 17, 2009, 12:12 PM

hello,
I have followed your protocol up to the last step of fixing cells on the slide.
How do I use the Giesma staining solution for G-banding?
Also, how do I stain the slides with DAPI?

thank you, Sharone

2

Reply

Posted by: sharone n.May 4, 2011, 2:31 PM

Hello Sharone,

it is worthmentioning that the G-banding protocol does not involves just Giemsa staining. It also involves trypsin treatment, incubation in phosphate buffer and the banding quality depends on a series of details, such as the time that your cells are storage in fixative solution, the time that your cells are in the slides, if your cells are from mouse or human...Unfortunately I don't have an efficient protocol to send to you by now, but you can search for one in cytogenetics books. I think you should try Human Cytogenetics (Rooney)

Regarding DAPI staining, you are going to incubate your slides for 5-10 min in DAPI solution and then rinse them in PBS 1X. Then, wait until the slides air-dry and mount them onto coverslips with an antifade solution. It is easy.

I hope I had help you!
Best wishes,
Rafaela Sartore

2.1

Reply

Posted by: Stevens R.May 27, 2011, 2:53 PM

I came across your article entitled Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping which was very interesting but i am unable read the full length article, please help me in this regard.
Thanks in advance
NAMBI
E-Mail id : ksnambi@gmail.com

4

Reply

Posted by: K.S.NATHIGA N.May 13, 2012, 1:01 PM

Your protocol is very thorough and helpful! BTW, how many chromosome spreads do you count? And what is the cutoff % of euploidy that represent good quality of cell lines? Thanks!

5

Reply

Posted by: Jinny K.September 13, 2012, 1:07 PM

Hi Jinny,
We are very pleased to know that the protocol is helping others in their experiments.
When talking about classical cytogenetic people usually count an average of 20 metaphases but we believe that at least 50 metaphases are required to have an overview of the sample.
The cutoff % of euploidy will depend on the type of cell. I suggest you to check the literature for having a clue about your cells.
For embryonic stem cells, for example, we consider the sample as good when the amount of euploidy is over 75%.

Hope I have helped you!
Best,
Priscila Britto

5.1

Reply

Posted by: Stevens R.September 20, 2012, 7:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter