Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

, , ,

Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.226.5.29, User IP: 54.226.5.29, User IP Hex: 920782109

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Campos, P. B., Sartore, R. C., Abdalla, S. N., Rehen, S. K. Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping. J. Vis. Exp. (31), e1512, doi:10.3791/1512 (2009).

Abstract: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

למרות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הוכחו מציגים קריוטיפ דיפלואידי יציב 1, מחקרים רבים דיווחו כי בהתאם לתנאי התרבות הם הופכים נוטה לרכוש מומים כרומוזומליים כגון תוספת של שלם או חלקי כרומוזומים. ואכן, במהלך לתרבות לטווח ארוך, שינויים karyotypic הם נצפו כאשר אנזימטית או כימי דיסוציאציה משמשים 2,3,4, בעוד דיסקציה ידנית של המושבות עבור passaging שומרת קריוטיפ יציב 5. חוץ מזה, שינויים בסביבה, כגון הסרת תאים מזין גם נראה להתפשר על שלמות הגנטי של hESC 3,6. לאחר שינויים כרומוזומליים יכולים להשפיע על הפיזיולוגיה הסלולר, אפיון של שלמות הגנטי של hESC במבחנה הוא hESC בהתחשב מכריע ככלי חיוני במחקרים embryogenesis בדיקות סמים. יתר על כן, למטרות טיפוליות עתידיות שינויים כרומוזומליים הם חשש ממשי כפי שהוא מזוהה לעתים קרובות סרטן.

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ושימושית להשיג איכות גבוהה כרומוזום מתפשט עבור ניתוח בדיעבד של כרומוזום שנקבעו על ידי G-banding SKY, דגים או טכניקות CGH 7,8. אנו ממליצים לבדוק את מצב הכרומוזומים באופן שגרתי במרווחים של 5 קטעים על מנת לפקח על המראה של טרנסלוקציות ו aneuploidies

Priscila Britto ו Rafaela Sartore תרמו באופן שווה על הנייר.

Protocol: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

ציוד

  • רקמות תרבות חממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2
  • סרכזת
  • סט של micropipettors (100, 100μL)
  • המים באמבטיה 37 ° C
  • אמבט המים 90 מעלות צלזיוס להיות מקור של מים קיטור
  • בניגוד שלב מיקרוסקופ

צעד ראשון

טיפול בתאי עם colcemid

בהליך זה השתמשנו קו hESC H9 תרבותי על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C (Sigma) ומתוחזק DMEM/F12 (Invitrogen) בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR, Gibco) ו 8ng/mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2, R & D).

כדי לקבל מספר גדול של ממרחים metaphases, מומלץ להשתמש תרבויות עם מדד גבוה mitotic שבו יש חלוקת תאים רבים.

  1. קח את הבקבוק תרבות מן החממה, בזרימה למינרית, להוסיף Colcemid בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור ולחכות 3 שעות כל כך מעכב יכולה לגרום למעצר mitotic על metaphase, כאשר כרומוזומים מרוכזים היטב ניתן דמיינו בקלות מתחת למיקרוסקופ.

תיקון התאים

  1. קחו את המדיום ולהוסיף tripsin / EDTA 0.05% מספיק כדי לכסות את פני השטח לתאים. אפשר תאים כדי לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשבית את האנזים או על ידי הוספת בינוני תרבות המכילה סרום או פשוט על ידי הוספת נסיוב לתאים.
    הערה: חשוב לוודא כי השעיה תא בודד מושגת להשיג מתפשט metaphase טוב.
  2. העברת התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ו - 122 גרם ב צנטריפוגות במשך 5 דקות.
  3. בטל supernatant, והשאיר על 200 מ"ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על הצינור, כפי שמוצג בסרטון. ודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה.
  4. הבא תצטרך להוסיף 5 מ"ל של תמיסת hypotonic (KCl 75mm) מראש לחמם 37 ° C, לאט, על ידי הקיר צינור כמו בתיאור הבא. ראשית להוסיף 3 מ"ל, להפוך לצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים עם פתרון hypotonic מכן להוסיף את שאר מ"ל 2 ו להתחמם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    הערה: בשלב זה הפתרון hypotonic יגרום לעלייה בנפח הסלולר לעזור לפענח את הכרומוזומים. זמן הדגירה חשוב לרכוש מתפשט כרומוזום טוב. אם העיתוי הוא ארוך מדי, קרום התא עשוי לפרוץ מוקדם מדי כרומוזומים יאבדו. אם קצר מדי, זה יכול להיות קשה להשיג מתפשט כרומוזום כי קרום התא לא יכול לשבש.
  5. הוסף 3 טיפות של הפתרון מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), להפוך את הצינור בעדינות כדי לערבב את הפתרון מקבע עם תאים צנטריפוגות ב 122 גר 'במשך 5 דקות ללא הפסקה.
    הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה.
    הערה: חשוב להשתמש צנטריפוגה ללא הפסקה, כדי למנוע שחיקה התאים, מניעת אובדן של החומר.
  6. בטל supernatant, והשאיר על 200 מ"ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור.
    הערה: שוב, לוודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה.
  7. מוסיפים את הראשון 3 מ"ל של תמיסת מקבע, לאט ליד הקיר צינור, תוך כדי לסובב את הצינור. הפוך את הצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים, ולאחר מכן להוסיף עוד 2 מ"ל של הפתרון מקבע ליד הקיר צינור לקחת את התאים מטה. במלאי ב 4 ° C למשך הלילה.
    הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן פתרון מקבע במשך חודשים 4 ° C. מלבד הגנה על תאים במצב נפוח שלהם, הפתרון מקבע מסיר שומנים וחלבונים denatures. אירועים אלה להפוך את קרום התא שברירי, וכתוצאה מכך, להפוך את כרומוזום מתפשטת בקלות.

ניקוי שקופיות הזכוכית

לפני תחילת ביצוע מתפשט כרומוזום שלך לוודא כי השקופיות מנקים כמו שצריך אחרת אתם עלולים לאבד כמה גרעינים וגם metaphases. שלב זה הוא חשוב גם אם אתה רוצה לנסות כל טכניקה הכלאה 9.

  1. המקום שקופיות כוס המכילה HCl 6M לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר תקופה זו, לשטוף במים זורמים שקופיות ברז למשך 10 דקות.
  3. שטפו את השקופיות במים מזוקקים ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר.
  4. עכשיו השקופיות ניתן לאחסן לתוך אתנול 96% מיובשים עם ונטולת מוך מיד לפני השימוש.

הערה: לקבלת בשיטות הכלאה באתרו, השקופיות לא ניתן לאחסן יותר מ 2 ימים לתוך אתנול 96%

שלב השני

כביסה התאים

  1. למחרת, צנטריפוגה התאים ב 122 גר 'במשך 5 דקות ללא הפסקה.
  2. Discard supernatant עוזב על 200 מ"ל. Resuspend גלולה מצליף בעדינות על ידי צינור ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל של תמיסת טרי מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), לאט ליד הקיר צינור תוך סיבוב הצינור. חזור על שלב 2 לשטוף יותר פעמים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
    הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה.

הכנת שקופיות

  1. בצעד צנטריפוגה האחרון לעזוב כמות מספקת של פתרון homogenize התא גלולה ולקבל צפיפות מספקת של תאים השקופיות (ראה תרשים 1).
  2. הוסף 20-30 μL ההשעיה תא לשקופית יבש ונקי על ידי העברת פיפטה קרוב מאוד ובמקביל פני השטח. כמו מתאדה פתרון מקבע, את פני השטח של שקופיות הופך מגורען.
  3. מיד לחשוף את השקופית, עם הפנים כלפי מעלה, לתוך האדים של מים חמים (90 מעלות) למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים לפוצץ.
    הערה: ברגע זה, מתנול מ מתאדה פתרון מקבע, וכתוצאה מכך גדל ריכוז חומצה אצטית, אשר יחד עם המים מגרה את כרומוזום מתפשטת.
  4. תראו מיקרוסקופ לעומת השלב רק כדי לבדוק אם הריכוז כמו גם את חלוקת התא הוא טוב (ראו תרשים 1).
  5. עכשיו השקופיות מוכנים לשמש כדי לבדוק את ערכה של כרומוזומים על ידי גישות cytogenetics כמו ה-G-banding (Giemsa) SKY, דגים, או CGH.

חשוב רמזים

איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח

בחירת metaphases עגולים מבודדים (דמות 2D), אתה עשוי להימנע בהתחשב aneuploidies כוזבת רווח של כרומוזומים שנוצר על ידי שניים או יותר מרווחי מעורבבים יחד או אובדן של כרומוזומים שנוצר על ידי כרומוזום השיק. אז, להימנע מבחירת metaphases ליד גרעינים כי כמה כרומוזומים עשוי להיות מוסתר על ידי אותם (דמות 2 א ו -2). חוץ מזה, לחפש metaphases עגול להיות בטוח כי כל כרומוזום מופרד מן metaphase (דמות 2C).

מזין תאים קריוטיפ hESC

עבור ה-G-banding וניתוח SKY, נוכחות של תאים מזין בתרבות hESC לא להפריע התוצאות, כי התאים מזין אינם תחת מדינה חלוקת (מומת על ידי mitomycin C או הקרנה) ולא יהיה חלק מהאוכלוסייה metaphase. עם זאת, עבור היישום של טכניקה דגים גרעינים שלבי הביניים, הוא העדיף להפריד את האוכלוסייה hESC מתאי מזין ידי קצירת המושבות ידנית לפני trypsinization לניתוח FISH.

איור 1
איור 1: איך לדעת את צפיפות התאים המתאימים השקופיות. תמונות של המיקרוסקופ שלב הניגוד אובייקטיבי 10x. (א) צפיפות התאים גבוהה מדי. החיצים מצביעים על metaphase מתפשטת קרוב מדי של גרעינים. (ב) שקופית עם צפיפות התאים טוב. חוגים מראים metaphases מתפשט מבודד גרעינים או metaphases אחרים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2
איור 2: איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח. הכרומוזומים הם מוכתמים DAPI ותמונות מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב אובייקטיבית 100x. (א) (ב) להימנע metaphases ליד גרעינים (מסומנת בחצים) (C) metaphases לא עגול כי הכרומוזומים מופרדים נוכח (עיגול). (ד) metaphase עגול הוא metaphase טוב כדי להיות מנותח. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

הכנת ממרחים כרומוזום הוא שלב קריטי לניתוח מוצלח של מצב גנטי של תאים עובריים באופן שגרתי על ידי טכניקות כמו ה-G-banding, טכניקות מתוחכמות יותר כגון דגים, SKY ו - CGH.

הליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים רבים על ידי שינוי תקופת הדגירה colcemid, אשר תלוי באורך מחזור התא. עבור מושבות של תאים עובריים, נחכה 3 שעות ואילו גופים embryoid (EB) זמן זה יכול להיות עד 6 שעות.

במקרה של עובד עם אגרגטים תאים (כמו גופים embryoid) תצטרך לנתק היטב כדי להשיג פתרון תא בודד. במקרה זה, לאחר טריפסין מכני דיסוציאציה, אתה יכול לעשות שימוש מסננת תא 40μm ניילון (BD Biosciences) ולאחר מכן לתת רצף הנוהל (משלב 4 בנושא הנהלים).

בהליך המתואר כאן ראוי לציין כי ההשעיה התא הוא ירד "מקרוב" על השקופיות כדי למנוע התפשטות מוגזמת של הכרומוזומים וכתוצאה מכך הדור של חפצים.

אנו מאמינים כי פרוטוקול זה הוא כלי שימושי ופשוט להיות מיושם באופן שגרתי לא רק על ידי מעבדות עוסקים בתאי גזע עובריים אלא על ידי חוקרים אחרים המעוניינים ללמוד יציבות כרומוזומלית בתאי גזע אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Materials: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Techno Plastic Products 91015
Colcemid Karyo MAX GIBCO, by Life Technologies 15212-012
EDTA Isofar 721
Glacial acetic acid Isofar 100
Methanol Isofar 208
Potassium Chloride (KCl) Merck & Co., Inc. 104.931.000
Slide Bioslide 7105-1
Tripsin Sigma-Aldrich T4799

References: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

  1. Thomson, J. A. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 (5391), 1145 (1998).
  2. Draper, J. S. et al., Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 22 (1), 53 (2004).
  3. Maitra, A. et al., Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet 37 (10), 1099 (2005).
  4. Mitalipova, M. M. et al., Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23 (1), 19 (2005).
  5. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., and Colman, A., Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol 22 (4), 381 (2004); Caisander, G. et al., Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res 14 (2), 131 (2006).
  6. Imreh, M. P. et al., In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem 99 (2), 508 (2006).
  7. Robin-Wesselschmidt, Jeanne Loring;, in Human Stem Cell Manual, edited by Jeanne F Loring; Robin L Wesselschmidt and Philip H Schwartz (Elsevier's Science & Technology Rights, California), pp. 59 (2007).
  8. Rooney, D. E., Human Cytogenetics, Third Edition ed. (Oxford University Press, 2001).
  9. Heslop-Harrison, Trude Schwarzacher;, in Practical in situ hybridization, edited by Trude Schwarzacher and Heslop-Harrison (BIOS Scientific Publishers, Oxford), pp. 51 (2000).

Ask the Author: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

4 Comments

The procedure seems easy enough, but how do you analyze the chromosomes? We don't have any experience.
Thank-you

1

Reply

Posted by: R. CottermanNovember 17, 2009, 12:12 PM

hello,
I have followed your protocol up to the last step of fixing cells on the slide.
How do I use the Giesma staining solution for G-banding?
Also, how do I stain the slides with DAPI?

thank you, Sharone

2

Reply

Posted by: sharone n.May 4, 2011, 2:31 PM

Hello Sharone,

it is worthmentioning that the G-banding protocol does not involves just Giemsa staining. It also involves trypsin treatment, incubation in phosphate buffer and the banding quality depends on a series of details, such as the time that your cells are storage in fixative solution, the time that your cells are in the slides, if your cells are from mouse or human...Unfortunately I don't have an efficient protocol to send to you by now, but you can search for one in cytogenetics books. I think you should try Human Cytogenetics (Rooney)

Regarding DAPI staining, you are going to incubate your slides for 5-10 min in DAPI solution and then rinse them in PBS 1X. Then, wait until the slides air-dry and mount them onto coverslips with an antifade solution. It is easy.

I hope I had help you!
Best wishes,
Rafaela Sartore

2.1

Reply

Posted by: Stevens R.May 27, 2011, 2:53 PM

I came across your article entitled Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping which was very interesting but i am unable read the full length article, please help me in this regard.
Thanks in advance
NAMBI
E-Mail id : ksnambi@gmail.com

4

Reply

Posted by: K.S.NATHIGA N.May 13, 2012, 1:01 PM

Your protocol is very thorough and helpful! BTW, how many chromosome spreads do you count? And what is the cutoff % of euploidy that represent good quality of cell lines? Thanks!

5

Reply

Posted by: Jinny K.September 13, 2012, 1:07 PM

Hi Jinny,
We are very pleased to know that the protocol is helping others in their experiments.
When talking about classical cytogenetic people usually count an average of 20 metaphases but we believe that at least 50 metaphases are required to have an overview of the sample.
The cutoff % of euploidy will depend on the type of cell. I suggest you to check the literature for having a clue about your cells.
For embryonic stem cells, for example, we consider the sample as good when the amount of euploidy is over 75%.

Hope I have helped you!
Best,
Priscila Britto

5.1

Reply

Posted by: Stevens R.September 20, 2012, 7:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter