Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

, , ,

Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 107.20.129.212, User IP: 107.20.129.212, User IP Hex: 1796506068

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Campos, P. B., Sartore, R. C., Abdalla, S. N., Rehen, S. K. Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping. J. Vis. Exp. (31), e1512, doi:10.3791/1512 (2009).

Abstract: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) istikrarlı bir diploid karyotip 1 sunmak için gösterilmiş olsa da, pek çok çalışmada, kültür koşullarına bağlı olarak bütün ek veya kromozom parçaları gibi kromozomal anomaliler elde eğilimli hale bildirmişlerdir. Gerçekten de, enzimatik veya kimyasal disosiasyon 2,3,4 kullanıldığında Pasajlanması için koloniler manuel diseksiyon istikrarlı bir karyotip 5 korur, uzun vadeli kültür sırasında karyotipik değişiklikler gözlenir. Bunun yanı sıra, besleyici hücrelerin ortadan kaldırılması gibi çevre değişiklikleri de hESC 3,6 genetik bütünlüğünü tehlikeye görünüyor. Kromozomal bozukluklar önemli dikkate alınarak hESC embriyogenez çalışmaları ve uyuşturucu testi için gerekli bir araç olarak, in vitro genetik bütünlüğü hESC karakterizasyonu hücresel fizyoloji etkileyebilir. Ayrıca, gelecekte tedavi amaçlı kromozomal değişiklikler sık ​​karsinogenez ilişkili olarak gerçek bir endişe vardır.

Burada G-bantlama, FISH, SKY veya CGH teknikleri 7,8 kromozom sonraki analiz için yüksek kalitede kromozom yayılır elde etmek için basit ve kullanışlı bir yöntem gösteriyor . Translokasyonlar ve anöploidiler görünümünü izlemek için rutin kromozomal durumu 5 pasajların aralıklarla kontrol etmenizi öneririz

Priscila Britto ve Rafaela Sartore kağıt üzerinde eşit olarak katkıda bulundu.

Protocol: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

EKİPMAN

  • Doku kültürü inkübatör, 37 ° C,% 5 CO 2
  • Santrifüj
  • Set micropipettors (100 100μL)
  • Su banyosu, 37 ° C
  • Su banyosu, 90 ° C buhar su kaynağı olarak
  • Faz kontrast mikroskobu

İLK ADIM

Colcemid ile hücrelerin tedavisi

Bu prosedürde,% 20 nakavt serum replasmanı (KSR, Gibco) ve 8ng/mL, ile desteklenmiş, mitomisin C (Sigma) ile inaktive ve DMEM/F12 (Invitrogen) muhafaza fare embriyonik fibroblastlar (MEF) üzerine kültür H9 hESC hattı fibroblast büyüme faktörü (FGF-2, Ar-Ge).

Metafaz yayılır, çok sayıda elde etmek için, birçok bölünen hücreleri vardır yüksek mitotik indeksi ile kültürlerin kullanılması tavsiye edilir.

  1. Inkübatör kültür şişesi alın ve laminer akış, son bir 0,1 mg / ml konsantrasyonda Colcemid eklemek.
  2. Inkübatör balon dönün ve 3 saat bekleyin inhibitörü, kromozomlar yoğunlaşmış ve mikroskop altında kolayca görüntülenebilmekte metafaz, mitoz tutuklama neden olabilir.

Hücrelerin Tespit

  1. Orta çıkarın ve hücrelerin yüzeyini kaplayan tripsin / EDTA% 0.05 'yeterli eklemek. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve sonra serum içeren kültür ortamı ekleyerek veya sadece hücreler serum ekleyerek ya enzim inaktive etmek için izin verin.
    NOT: iyi metafaz yayılır elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu elde edilir emin yapmak için çok önemlidir.
  2. 15 ml santrifüj tüpüne ve 5 dakika boyunca 122 g santrifüj hücrelere aktarın.
  3. 200 ml hakkında bırakarak süpernatantı atın ve hafifçe videoda gösterildiği gibi tüp, dokunarak pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin iyi ayrışmış, bu nedenle çözüm kümeleri görselleştirmek emin olun.
  4. Sonra 5 ml hipotonik çözüm (KCl 75mm) 37 önceden ısıtılmış ° C, yavaş yavaş, aşağıdaki açıklamayı olduğu gibi tüp duvar eklemeniz gerekecektir İlk tüp invert hipotonik bir çözüm hemen sonra hücrelerin bir arada kalan 2 ml ekleyin ve 37 sıcak tutmak ° C 15 dakika boyunca yatay konumda, 3 ml ekleyin.
    NOT: Bu noktada hipotonik çözüm hücresel birimde bir artışa neden ve kromozomlar ayıklayabilir yardımcı olacaktır. Inkübasyon süresi, iyi bir kromozom elde etmek için önemlidir. Zamanlaması çok uzun ise, hücre zarı, çok erken ve kromozomlar kaybolur patlayabilir. Eğer çok kısa olursa, hücre zarı bozabilir çünkü kromozom yayılır elde etmek zor olabilir.
  5. Fiksatif solüsyonu (metanol / asetik asit buzul 03:01) 3 damla ekleyin, 5 dakika ara vermeden 122 g hücreleri ve santrifüj fiksatif çözüm karıştırmak için tüp nazikçe çevirin.
    NOT: fiksatif solüsyon taze yapılmalıdır.
    NOT: malzeme kaybını önleyerek, hücrelerin yıpratma önlemek için ara vermeden santrifüj kullanmak önemlidir.
  6. 200 ml hakkında bırakarak süpernatantı atın ve yavaşça tüpün alt dokunarak pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
    NOT: Yine, hücrelerin iyi ayrışmış, bu nedenle çözüm kümeleri görselleştirmek emin olun.
  7. Tüp döndürmek ederken, yavaş yavaş, fiksatif çözüm tüp duvar ilk 3 mL ekleyin. Hücrelerin karışımı, ve daha sonra tüp duvar hücreleri aşağı çekmek için 2 mL fiksatif çözüm daha eklemek için yatay pozisyonda Tüpü ters çevirin. 4 ° C gecede Stok.
    NOT: sabit hücreler, 4 ay için sabitleştirici çözüm saklanabilir ° C Kendi şişmiş durumda hücrelerini koruyarak yanı sıra, fiksatif çözüm lipitleri ve denatüre proteinlerin ortadan kaldırır. Bu olaylar sonucunda, kromozom kolayca yayılmasını, hücre zarının kırılgan yapmak ve.

CAM KAYDIRAKLARI TEMİZLİK

Kromozom yayılır slaytlarınız düzgün bir şekilde temizlenir veya bazı çekirdeklerin kaybedebilirsiniz ve aynı zamanda metafaz ki emin olun başlamadan önce. Eğer herhangi bir hibridizasyon tekniği 9 denemek istiyorsanız bu adımı yanı sıra önemlidir .

  1. Yeri oda sıcaklığında en az 3 saat 6M HCl içeren bir beher slaytlar.
  2. Bu süreden sonra, 10 dakika boyunca çalışan musluk suyu slaytlar yıkayın.
  3. Slaytları distile su ile çalkalayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
  4. Şimdi slaytlar% 96 etanol içinde saklanan ve kullanmak için bir havsız hemen önce kurutulmuş olabilir.

NOT: situ hibridizasyon yöntemleri için, slaytlar, en fazla 2 gün boyunca% 96 etanol içine saklanabilir olamaz

İkinci adım

Çamaşır hücreler

  1. Ertesi gün, 5 dakika ara vermeden 122 g hücreler santrifüj.
  2. D200 ml bırakarak süpernatant iscard. Nazikçe tüp dönerken tüp tüp duvar sonra yavaş yavaş taze fiksatif solüsyonu 5 ml (metanol / asetik asit buzul 03:01) eklemek Flicking pelletini tekrar. Bu yıkama üç yıkama olmak üzere toplam 2 kez daha adımı yineleyin.
    NOT: fiksatif solüsyon taze yapılmalıdır.

Slaytlar hazırlanması

  1. (Bkz. Şekil 1) hücre pelletini homojenize ve slaytlar hücrelerin yeterli bir yoğunluk elde etmek için çözüm son santrifüj aşamada yeterli miktarda bırakın.
  2. 20-30 mcL hücre süspansiyonu, temiz ve kuru bir slayt yüzeye çok yakın ve paralel hareket pipet üzerine ekleyin. Fiksatif çözüm buharlaşır gibi, slayt yüzeyi grenli olur.
  3. Hemen havaya uçurmak hücrelerin neden 30 saniye süreyle sıcak su, buhar (90 °) içine, slayt maruz yüzü yukarı.
    NOT: Şu anda, asetik asit konsantrasyonu artmış ile sonuçlanan, metanol, fiksatif çözüm buharlaşır, su ile birlikte yayılan kromozom uyarır.
  4. Açabildiği gibi, hücre dağılımı (bkz. Şekil 1) iyi olup olmadığını kontrol etmek için bir faz kontrast mikroskobu bakın.
  5. Şimdi slaytlar G-bantlama (Giemsa), FISH, SKY veya CGH gibi yaklaşımlar sitogenetik kromozom seti kontrol etmek için kullanılmaya hazır.

ÖNEMLİ İPUÇLARI

Nasıl tercih analiz edilmesi için yeterli bir metafaz

Yuvarlak ve izole metafaz (Şekil 2B) seçmek, iki veya daha fazla kromozom kazanç birlikte karışık veya başlattı kromozom tarafından oluşturulan kromozom kaybı yayılır yanlış anöploidiler dikkate kaçınmak olabilir. Yani, bazı kromozom (Şekil 2A ve 2B) tarafından gizli olabilir çünkü çekirdekleri yakın metafaz seçerek kaçının. Ayrıca, yuvarlak metafaz bakmak ve herhangi bir kromozom metafaz (Şekil 2C) ayrılmış olduğundan emin olun.

Besleyici hücreleri ve hESC karyotip

G-bantlama ve SKY analizi için, besleyici hücreler bölünerek devlet (mitomisin C veya ışınlama ile inaktif) altında değildir ve metafaz nüfusunun parçası olmayacaktır çünkü besleyici hücreler hESC kültür varlığı, sonuçları ile müdahale değildir. Ancak,, interfaz çekirdekleri FISH tekniğinin uygulanması için, besleyici hücrelerin koloniler FISH analizi için trypsinization önce elle hasat hESC nüfus ayırmak için tercih edilir.

Şekil 1
Şekil 1: slayt uygun hücre yoğunluğu nasıl biliyoruz. 10x objektif faz kontrast mikroskop görüntülerini. (A) hücre yoğunluğu çok yüksek. Ok çok yakın çekirdekleri yayılır metafaz işaret etmektedir. (B) iyi bir hücre yoğunluğu ile bir slayt. Çevreler, çekirdekleri veya diğer metafaz izole metafaz yayılır göstermektedir. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .

Şekil 2
Şekil 2: Nasıl analiz edilmesi için yeterli bir metafaz seçin. Kromozomlar DAPI ve 100x objektif bir floresan mikroskobu ile elde edilen görüntüler ile boyandı. (A) (B) çekirdekleri yakın metafaz kaçının (oklarla gösterilen) (C) ve mevcut kromozom ayrılmış (daire) yuvarlak değil metafaz. (D) yuvarlak metafaz analiz edilmesi için iyi bir metafaz. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Kromozom yayılır hazırlık, G-bantlama ve BALIK, SKY ve CGH gibi daha sofistike teknikler olarak rutin teknikleri ile embriyonik kök hücrelerin genetik bir durum başarılı bir analiz için önemli bir adım.

Bu prosedür, hücre döngüsü uzunluğu bağlıdır colcemid kuluçka döneminde değişen birçok hücre tipleri için uygulanabilir. (EB) embriyoid organları için bu süre 6 saate kadar ise embriyonik kök hücre kolonileri için, biz 3 saat bekleyin.

, Tek bir hücre çözümü elde etmek için çok iyi ayırmak gerekecektir hücre agrega (embriyoid organları gibi) ile çalışma durumunda. Bu durumda, tripsin ve mekanik disosiasyon sonra 40μm naylon hücre süzgecinden (BD Biosciences) ve (usul konunun adım 4) prosedürü sıralaması verir.

Burada prosedür hücre süspansiyonu kromozomlar ve dolayısıyla eserler nesil aşırı yayılmasını önlemek amacıyla "yakından" Slaytlarınıza bırakılan fazlalaştı nitelendirdi.

Biz bu protokolü, sadece embriyonik kök hücreleri ile ilgili laboratuarlar tarafından değil, diğer kök hücrelerin kromozom istikrarsızlık okuyan ilgilenen diğer araştırmacılar tarafından rutin olarak uygulanması gereken bir kullanışlı ve basit bir araç olduğuna inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Materials: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Techno Plastic Products 91015
Colcemid Karyo MAX GIBCO, by Life Technologies 15212-012
EDTA Isofar 721
Glacial acetic acid Isofar 100
Methanol Isofar 208
Potassium Chloride (KCl) Merck & Co., Inc. 104.931.000
Slide Bioslide 7105-1
Tripsin Sigma-Aldrich T4799

References: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

  1. Thomson, J. A. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 (5391), 1145 (1998).
  2. Draper, J. S. et al., Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 22 (1), 53 (2004).
  3. Maitra, A. et al., Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet 37 (10), 1099 (2005).
  4. Mitalipova, M. M. et al., Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23 (1), 19 (2005).
  5. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., and Colman, A., Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol 22 (4), 381 (2004); Caisander, G. et al., Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res 14 (2), 131 (2006).
  6. Imreh, M. P. et al., In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem 99 (2), 508 (2006).
  7. Robin-Wesselschmidt, Jeanne Loring;, in Human Stem Cell Manual, edited by Jeanne F Loring; Robin L Wesselschmidt and Philip H Schwartz (Elsevier's Science & Technology Rights, California), pp. 59 (2007).
  8. Rooney, D. E., Human Cytogenetics, Third Edition ed. (Oxford University Press, 2001).
  9. Heslop-Harrison, Trude Schwarzacher;, in Practical in situ hybridization, edited by Trude Schwarzacher and Heslop-Harrison (BIOS Scientific Publishers, Oxford), pp. 51 (2000).

Ask the Author: Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

4 Comments

The procedure seems easy enough, but how do you analyze the chromosomes? We don't have any experience.
Thank-you

1

Reply

Posted by: R. CottermanNovember 17, 2009, 12:12 PM

hello,
I have followed your protocol up to the last step of fixing cells on the slide.
How do I use the Giesma staining solution for G-banding?
Also, how do I stain the slides with DAPI?

thank you, Sharone

2

Reply

Posted by: sharone n.May 4, 2011, 2:31 PM

Hello Sharone,

it is worthmentioning that the G-banding protocol does not involves just Giemsa staining. It also involves trypsin treatment, incubation in phosphate buffer and the banding quality depends on a series of details, such as the time that your cells are storage in fixative solution, the time that your cells are in the slides, if your cells are from mouse or human...Unfortunately I don't have an efficient protocol to send to you by now, but you can search for one in cytogenetics books. I think you should try Human Cytogenetics (Rooney)

Regarding DAPI staining, you are going to incubate your slides for 5-10 min in DAPI solution and then rinse them in PBS 1X. Then, wait until the slides air-dry and mount them onto coverslips with an antifade solution. It is easy.

I hope I had help you!
Best wishes,
Rafaela Sartore

2.1

Reply

Posted by: Stevens R.May 27, 2011, 2:53 PM

I came across your article entitled Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping which was very interesting but i am unable read the full length article, please help me in this regard.
Thanks in advance
NAMBI
E-Mail id : ksnambi@gmail.com

4

Reply

Posted by: K.S.NATHIGA N.May 13, 2012, 1:01 PM

Your protocol is very thorough and helpful! BTW, how many chromosome spreads do you count? And what is the cutoff % of euploidy that represent good quality of cell lines? Thanks!

5

Reply

Posted by: Jinny K.September 13, 2012, 1:07 PM

Hi Jinny,
We are very pleased to know that the protocol is helping others in their experiments.
When talking about classical cytogenetic people usually count an average of 20 metaphases but we believe that at least 50 metaphases are required to have an overview of the sample.
The cutoff % of euploidy will depend on the type of cell. I suggest you to check the literature for having a clue about your cells.
For embryonic stem cells, for example, we consider the sample as good when the amount of euploidy is over 75%.

Hope I have helped you!
Best,
Priscila Britto

5.1

Reply

Posted by: Stevens R.September 20, 2012, 7:48 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter