Kromosomala Sprid Beredning av mänskliga embryonala stamceller för karyotypning

UTRUSTNING

• Vävnadskultur inkubator, 37 ° C, 5% CO ₂
• Centrifugera
• Set med micropipettors (100, 100μL)
• Vattenbad 37 ° C
• Vattenbad 90 ° C för att vara källa för ånga vatten
• Faskontrastmikroskop

FÖRSTA STEG

Att behandla cellerna med Colcemid

I detta förfarande använde vi hESC linjen H9 odlade på möss embryonala fibroblaster (MEF) inaktiveras med mitomycin C (Sigma) och hållas i DMEM/F12 (Invitrogen) kompletteras med 20% knockout serum ersättare (KSR, Gibco) och 8ng/mL av fibroblast tillväxtfaktor (FGF-2, R & D).

För att få ett stort antal metafaser sprider, är det rekommenderat att använda kulturer med hög mitotiskt index där det finns många celler som delar sig.

1. Ta kulturen kolven från inkubatorn och i laminärt flöde, lägga Colcemid till en slutlig koncentration på 0,1 mikrogram / ml.
2. Återgå kolven till inkubatorn och vänta 3 timmar så hämmare kan orsaka mitotiska gripandet den metafas, när kromosomerna är väl kondenseras och kan enkelt visualiseras i mikroskop.

Fastställande av cellerna

3. Ta ut medellång och lägga tripsin / EDTA 0,05% räcker för att täcka cellerna ytan. Låt cellerna att inkubera 5 minuter vid rumstemperatur och sedan inaktivera enzymet antingen genom att lägga odlingsmedium som innehåller serum eller genom att bara lägga serum till cellerna.
   OBS: Det är viktigt att se till att en enda cell suspension erhålls att få bra metafas sprider sig.
4. Överför cellerna till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 122 gi 5 minuter.
5. Kasta bort vätskefasen, vilket innebär att ungefär 200 ml och suspendera pelleten försiktigt genom att knacka röret, som visas i videon. Se till att cellerna är väl dissocierade, så du kan inte visualisera någon klumpar i lösningen.
6. Härnäst kommer du att behöva lägga till 5 ml hypoton lösning (KCl 75mm) förvärmas till 37 ° C, långsamt, genom rörväggen som i följande beskrivning. Först tillsätts 3 ml, vänd röret till horisontellt läge bara att blanda celler med hypoton lösning och tillsätt sedan resterande 2 ml och håll varm vid 37 ° C i 15 minuter.
   OBS: Vid denna punkt hypoton lösning kommer att orsaka en ökning på cellulär volym och hjälpa till att reda ut kromosomerna. Tiden för inkubation är viktigt att skaffa bra kromosom sprider sig. Om tiden är för lång, kan cellmembranet brast för tidigt och kromosomer går förlorade. Om för kort kan det vara svårt att få kromosom sprids på grund av att cellmembranet inte kan störa.
7. Tillsätt 3 droppar av Fixeringslösning (metanol / isättika 3:1), vänd röret försiktigt för att blanda Fixeringslösning med cellerna och centrifugera vid 122 gi 5 minuter utan paus.
   OBS: Fixeringslösning bör nybakade.
   OBS: Det är viktigt att använda centrifugering utan avbrott för att undvika celler avgång, förhindra förlust av materialet.
8. Kasta bort vätskefasen, vilket innebär att ungefär 200 ml och suspendera pelleten försiktigt genom att knacka på botten av röret.
   OBS: Igen, se till att cellerna är väl dissocierade, så du kan inte visualisera någon klumpar i lösningen.
9. Tillsätt de första 3 mL Fixeringslösning, långsamt genom röret väggen, medan du roterar röret. Vänd röret till ett horisontellt läge bara att blanda celler, och sedan lägga till mer 2 ml av Fixeringslösning av rörväggen att ta celler nedåt. Lager vid 4 ° C över natten.
   OBS: Den fasta cellerna kan lagras i Fixeringslösning i månader vid 4 ° C. Förutom att skydda celler i sina svullna tillstånd, tar bort Fixeringslösning lipider och denaturerar proteiner. Dessa händelser gör cellmembranet bräcklig och, som en följd, gör kromosom sprider sig lätt.

RENGÖRING AV glasskivor

Innan du börjar göra din kromosom sprider se till att dina bilder är ordentligt rengjorda eller du kan förlora en del kärnor och även metafaser. Detta steg är också viktigt om du vill prova något hybridisering teknik ^9.

1. Placera objektglasen i en bägare som innehåller 6M HCl i minst 3 timmar vid rumstemperatur.
2. Efter denna tid, tvätta objektglasen i rinnande vatten i 10 minuter.
3. Skölj objektglasen i destillerat vatten och låt de torkar i rumstemperatur.
4. Nu bilderna kan lagras i 96% etanol och torkas av med en luddfri omedelbart före användning.

OBS: För in situ hybridisering metoder kan bilderna inte lagras i mer än 2 dagar i 96% etanol

Andra steget

Tvätta cellerna

10. Nästa dag, centrifugera cellerna vid 122 gi 5 minuter utan paus.
11. Discard supernatanten lämnar ca 200 ml. Suspendera pelleten genom att försiktigt vicka röret och tillsätt därefter 5 ml rent Fixeringslösning (metanol / isättika 3:1), långsamt genom röret väggen samtidigt roterar röret. Upprepa tvättningen två gånger för totalt tre tvättar.
    OBS: Fixeringslösning bör nybakade.

Förbereda bilder

12. Vid det senaste centrifugeringssteget lämna tillräcklig mängd lösning för att homogenisera cellpelleten och få en tillräcklig täthet av celler i bilder (se figur 1).
13. Tillsätt 20-30 mikroliter cellsuspension på en ren och torr bild genom att flytta pipetten mycket nära och parallellt med ytan. Som fixativ lösningen avdunstar, blir ytan av bilden kornig.
14. Omedelbart exponera bilden, uppåt, in i ånga av varmt vatten (90 °) i 30 sekunder för att orsaka cellerna sprängs.
    OBS: I detta ögonblick, att metanol från Fixeringslösning avdunstar, vilket resulterar i en ökad ättiksyra koncentrationen, som tillsammans med vattnet stimulerar kromosom spridning.
15. Titta på en faskontrastmikroskop bara för att kontrollera om koncentrationen samt cellen fördelningen är god (se figur 1).
16. Nu är bilderna är redo att användas för att kontrollera den uppsättning av kromosomer med cytogenetik metoder som G-banding (Giemsa), fisk, himmel eller CGH.

VIKTIGT TIPS

Hur väljer en lämplig metafas som skall analyseras

Att välja runda och isolerade metafaser (figur 2D), kan du undvika med tanke på falska aneuploidies som vinsten av kromosomer som genereras av två eller flera sprider blandade med varandra eller förlust av kromosomer som genereras av en lanserats kromosom. Så undviker du väljer metafaser nära kärnor eftersom vissa kromosomer kan döljas av dem (figur 2A och 2B). Dessutom leta efter runda metafaser och vara säker på att någon kromosom är separerad från metafas (figur 2C).

Feeder celler och hESC karyotyp

För G-bandning och SKY analys stör närvaron av feeder celler i hESC kultur inte med resultatet, eftersom feeder celler inte under en skiljelinje state (inaktiveras av mitomycin C eller strålning) och kommer inte att vara en del av metafas befolkningen. Men för tillämpningen av FISH-teknik i interfas kärnor är det att föredra att separera hESC befolkningen från feeder celler genom att skörda kolonierna manuellt innan trypsinization för FISH analys.

Figur 1: Hur vet lämplig celltätheten i bilderna. Bilder av faskontrastmikroskop i 10x mål. (A) celltäthet är för hög. Pilarna pekar på metafas sprider sig för utgången av atomkärnor. (B) En bild med bra celltäthet. Cirklarna visar metafaser sprider sig isolerade från kärnor eller andra metafaser. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2: Hur man väljer en lämplig metafas som skall analyseras. Kromosomer färgas med DAPI och bilder tagna av en fluorescerande mikroskop i 100x mål. (A) (b) Undvik metafaser nära atomkärnor (pilarna) (C) och metafaser inte runda som presenterar kromosomer separerade (cirkel). (D) En rund metafas är en bra metafas som skall analyseras. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Beredningen av kromosom sprider är ett kritiskt steg för en lyckad analys av den genetiska statusen av embryonala stamceller genom att rutinmässigt tekniker som G-banding, och mer sofistikerade tekniker som FISH, Sky och CGH.

Detta förfarande kan tillämpas för många celltyper genom att variera under Colcemid inkubation, vilket beror på cellcykeln längd. För kolonier av embryonala stamceller, väntar vi 3 timmar medan det för embryoid organ (EB) den här gången kan upp till 6 timmar.

I fallet av att arbeta med cellaggregat (som embryoid organ) måste du separera mycket bra för att få en enda cell lösning. I detta fall, efter att trypsin och mekaniska dissociation, kan du använda en 40μm nylon cell sil (BD Biosciences) och sedan ge sekvens av förfarandet (från steg 4 av förfarandena ämne).

I förfarandet beskrivs här är det värt att notera att cellsuspensionen tappas "nära" på bilderna för att undvika överdriven spridning av kromosomer och därmed generation av artefakter.

Vi tror att detta protokoll är ett nyttigt och enkelt verktyg att rutinmässigt tillämpas inte endast av laboratorier att göra med embryonala stamceller utan av andra forskare intresserade av att studera kromosomala instabilitet i andra stamceller.