Preparación Extienda los cromosomas de las células estaminales embrionarias para cariotipo

EQUIPO

• De cultivo de tejidos incubadora a 37 º C, 5% de CO ₂
• Centrífugo
• Juego de micropipetas (100, 100μL)
• Baño de agua 37 ° C
• Baño de agua a 90 ° C para ser fuente de vapor de agua
• Microscopio de contraste de fase

PRIMER PASO

Tratar las células con colcemid

En este procedimiento se utilizó la línea de células madre cultivadas H9 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados con mitomicina C (Sigma) y se mantuvieron en DMEM/F12 (Invitrogen), complementado con el reemplazo de octavos de final 20% de suero (KSR, Gibco) y de 8ng/mL factor de crecimiento fibroblástico (FGF-2, R & D).

Con el fin de obtener un gran número de los diferenciales de metafases, se recomienda el uso de cultivos con alto índice mitótico en el que hay muchas células que se dividen.

1. Tome el frasco de cultivo de la incubadora y, en el flujo laminar, añadir Colcemid a una concentración final de 0,1 mg / ml.
2. Volver el frasco a la incubadora y esperar 3 horas para que el inhibidor puede causar un paro mitótico en metafase, cuando los cromosomas están bien condensada y se pueden visualizar fácilmente bajo el microscopio.

La fijación de las células

3. Saque el medio y agregar tripsina / EDTA 0,05% suficiente para cubrir la superficie de las células. Permitir que las células se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego inactivar la enzima, ya sea por la adición de medio de cultivo que contiene suero o con sólo añadir suero de las células.
   NOTA: Es importante asegurarse de que una única suspensión de células se realiza para obtener una buena propaga metafase.
4. Transferencia de las células a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 122 g durante 5 minutos.
5. Descartar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 ml, y resuspender el precipitado suavemente tocando el tubo, como se muestra en el video. Asegúrese de que las células están bien disociado, por lo que no se puede visualizar cualquier grupo en la solución.
6. A continuación, tendrá que añadir 5 ml de solución hipotónica (KCl 75 mm) pre-calentado a 37 ° C, lentamente, por la pared del tubo como en la siguiente descripción. Primero se debe agregar 3 ml, invertir el tubo a una posición horizontal justo para mezclar las células con la solución hipotónica a continuación, añadir el resto de 2 ml y mantener caliente a 37 ° C durante 15 minutos.
   NOTA: En este punto la solución hipotónica se producirá un aumento en el volumen celular y ayudan a desenredar los cromosomas. El tiempo de incubación es importante para adquirir una buena extiende cromosoma. Si el tiempo es demasiado tiempo, la membrana celular puede explotar muy pronto y los cromosomas se han perdido. Si es demasiado corto, puede ser difícil de obtener porque se extiende el cromosoma de la membrana celular no puede alterar.
7. Añadir 3 gotas de la solución fijadora (metanol / ácido acético glacial 3:1), invertir el tubo suavemente para mezclar la solución de fijación con las células y se centrifuga a 122 g durante 5 minutos sin interrupción.
   NOTA: La solución de fijación debe estar recién hecho.
   NOTA: Es importante la utilización de la centrifugación sin descanso para evitar el desgaste células, evitando la pérdida del material.
8. Descartar el sobrenadante, dejando alrededor de 200 ml, y resuspender el precipitado suavemente tocando el fondo del tubo.
   NOTA: Una vez más, asegúrese de que las células están bien disociado, por lo que no se puede visualizar cualquier grupo en la solución.
9. Añadir los primeros 3 ml de solución fijadora, lentamente por la pared del tubo, mientras se gira el tubo. Invierta el tubo a una posición horizontal justo para mezclar las células, y luego añadir más 2 ml de la solución de fijación a la pared del tubo para tomar las células hacia abajo. De archivo a 4 ° C durante la noche.
   NOTA: Las células fijadas se pueden almacenar en la solución fijadora durante meses a 4 ° C. Además de proteger las células en su estado hinchado, la solución fijadora elimina los lípidos y las proteínas se desnaturaliza. Estos hechos hacen que la frágil membrana de la célula y, en consecuencia, que el cromosoma propaga fácilmente.

LIMPIEZA DE LA portaobjetos de vidrio

Antes de iniciar la toma se extiende a su cromosoma asegurarse de que las diapositivas se limpian correctamente o es posible que pierda algunos núcleos y también metafases. Este paso es también importante si quieres probar alguna técnica de hibridación ^9.

1. Coloque los portaobjetos en un vaso que contiene HCl 6M durante al menos 3 horas a temperatura ambiente.
2. Después de este tiempo, lavar los portaobjetos con agua corriente durante 10 minutos.
3. Enjuague los portaobjetos en agua destilada y dejar que se sequen a temperatura ambiente.
4. Ahora las diapositivas se pueden almacenar en 96% de etanol y se seca con un paño inmediatamente antes del uso.

NOTA: Para los métodos de hibridación in situ, las diapositivas no se pueden almacenar durante más de 2 días en etanol al 96%

SEGUNDO PASO

Lavado de las células

10. Al día siguiente, centrifugar las células a 122 g durante 5 minutos sin interrupción.
11. Discard el sobrenadante dejando alrededor de 200 ml. Resuspender el precipitado agitando suavemente el tubo a continuación, añadir 5 ml de solución fijadora fresca (metanol / ácido acético glacial 3:1), lentamente por la pared del tubo mientras se gira el tubo. Repita este paso de lavado dos veces más para un total de tres lavados.
    NOTA: La solución de fijación debe estar recién hecho.

Preparación de las diapositivas

12. En la última etapa de centrifugación dejar una cantidad suficiente de solución para homogeneizar el sedimento celular y obtener una densidad adecuada de las células en las diapositivas (ver figura 1).
13. Añadir 20-30 l de suspensión de células en un portaobjetos limpio y seco, moviendo la pipeta muy cerca y en paralelo a la superficie. Medida que se evapora la solución de fijación, la superficie de deslizamiento se convierte en granulado.
14. Inmediatamente, exponer la diapositiva, boca arriba, en el vapor de agua caliente (90 °) durante 30 segundos para hacer que las células explotan.
    NOTA: En este momento, el metanol se evapora de la solución de fijación, lo que resulta en una mayor concentración de ácido acético, que junto con el agua estimula la difusión de los cromosomas.
15. Mira a un microscopio de contraste de fase sólo para comprobar si la concentración, así como la distribución de las células es buena (ver figura 1).
16. Ahora las diapositivas están listos para ser utilizados para comprobar el juego de cromosomas mediante enfoques como la citogenética de bandas G (Giemsa), FISH, SKY y CGH.

CONSEJOS IMPORTANTES

¿Cómo elegir una metafase adecuados para ser analizados

La elección de metafases redondas y aisladas (figura 2D), es posible evitar la consideración de aneuploidías falsa como la ganancia de los cromosomas generados por dos o más se extiende mezclados entre sí o la pérdida de cromosomas generados por un cromosoma en marcha. Por lo tanto, evitar la elección de metafases cerca de los núcleos, ya que algunos cromosomas pueden estar ocultos por ellos (Figura 2A y 2B). Además, busca metafases ronda y estar seguros de que cualquier cromosoma se separa de la metafase (figura 2C).

Células alimentadoras y el cariotipo células madre

De bandas G y análisis SKY, la presencia de células alimentadoras en la cultura células madre no interferir con los resultados, porque las células de alimentación no están bajo un estado de división (inactivada por la mitomicina C o irradiación) y no será parte de la población de la metafase. Sin embargo, para la aplicación de la técnica de FISH en núcleos en interfase, es preferible separar a la población de células madre a las células de alimentación por la recolección de las colonias manualmente antes de tripsinización para el análisis de FISH.

Figura 1: ¿Cómo saber la densidad celular apropiada en las diapositivas. Las imágenes de microscopio de contraste de fase en el objetivo de 10x. (A) La densidad celular es muy alta. Las flechas indican la metafase se propaga muy cerca de los núcleos. (B) Una diapositiva con una buena densidad de las células. Los círculos muestran los diferenciales metafases aislado de núcleos o metafases otros. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2: ¿Cómo elegir una metafase adecuados para ser analizados. Los cromosomas son teñidos con DAPI y las imágenes obtenidas por un microscopio de fluorescencia en el objetivo de 100x. (A) (B) Evitar metafases cerca de los núcleos (indicado por las flechas) (C) y no metafases ronda que los cromosomas presentan separados (círculo). (D) A la metafase ronda es una metafase bueno para ser analizados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

La preparación de los diferenciales de los cromosomas es un paso crítico para el éxito de un análisis de la situación genética de las células madre embrionarias mediante técnicas de rutina como el G-bandas, y las técnicas más sofisticadas como el pescado, SKY y CGH.

Este procedimiento se puede aplicar a muchos tipos de células, variando el período de incubación colcemid, que depende de la duración del ciclo celular. Para las colonias de células madre embrionarias, que esperar 3 horas, mientras que para los cuerpos embrioides (EB), este tiempo puede ser de hasta 6 horas.

En el caso de trabajar con agregados de células (como los cuerpos embrioides) tendrá que disocian muy bien con el fin de obtener una solución única célula. En este caso, después de la tripsina y la disociación mecánica, puede hacer uso de un filtro de nylon de células 40μm (BD Biosciences) y luego dar la secuencia del procedimiento (desde el paso 4 del tema de procedimientos).

En el procedimiento descrito aquí vale la pena señalar que la suspensión de células se ha caído "de cerca" a las diapositivas con el fin de evitar una excesiva difusión de los cromosomas y, por consiguiente generación de artefactos.

Creemos que este protocolo es una herramienta útil y sencilla para ser aplicados de manera rutinaria, no sólo por los laboratorios que trabajan con células madre embrionarias, pero por otros investigadores interesados ​​en estudiar la inestabilidad cromosómica en células madre de otros.