Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Материалы и методы

1. Штаммов дрожжей и условий роста
   Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1.
2. Хранение дрожжевых клеток для экстракции липидов
   
   1. 50 мл культуры клеток собирают центрифугированием при 3000 мкг в течение 5 минут.
   2. Промывают два раза с холодной водой.
      1. Ресуспендируют гранул в 25 мл ледяной воды
      2. Гранул клеток в центрифуге при 3000 мкг в течение 5 минут
   3. Ресуспендируют гранул и трансфер в Эппендорф трубки
   4. Гранул путем центрифугирования, 16 000 мкг в течение 2 минут, удалите супернатант и заморозить при -80 ° C до использования. (Мы используем стакан изопропиловый спирт хранится в морозильной камере -80, жидкий азот также может быть использован)
3. Реагенты
   Biotech класса хлороформа и метанола от Sigma-Aldrich. Свободные жирные кислоты и триглицериды были приобретены у Larodan (Мальме, Швеция). Различные виды фосфолипидов - в том числе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерина, фосфатидная кислоты и cardiolipins - были получены из Avanti Полярный липидов (Alabaster, Алабама, США). Высокоскоростной стекла пробирок с тефлоновым выстроились шапки из Фишер.

Липидный добычи

Это изменение протокола описывается Блая и ​​Дайера ^8. Все манипуляции с извлекаемыми липидов должно быть сделано с помощью стеклянной пипетки или шприцы; пластмасс создаст большие фонового сигнала, если они вступают в контакт с хлороформом. Точные объемы не являются критическими тех пор, пока отношения 1:2:0.8 для хлороформ - метанол - H ₂ O на шаге 3 и 2:2:1.8 для хлороформ - метанол - H ₂ O в шаге 7 сохраняются.

1. Ресуспендируют замороженных клеток в 1,6 мл ледяной дистиллированной H ₂ O.
2. Передача 1,6 мл клеточной суспензии к высокоскоростному стеклянные трубки центрифуги.
3. Добавить 6 мл хлороформа и метанола (1:2) смеси и 0,8 мл стеклянных шариков для клеточной суспензии.
4. Vortex клеточной суспензии со стеклянными шариками два раза в течение 1 мин.
5. Добавьте 2 мл хлороформа и аккуратно перемешать.
6. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
7. Добавьте 2 мл дистиллированной H ₂ O и аккуратно перемешать.
8. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре с редкими смешивания.
9. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
10. Сбор всей жидкой фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
11. Добавить 3,2 мл хлороформа в камеру гранулы из шагу 9.
12. Vortex два раза в течение 1 мин.
13. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
14. Добавить супернатант в жидкую фазу, начиная с шага 10.
15. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
16. Откажитесь от верхней (водный) фазы и передачу ниже (органические) фазы в новой высокоскоростной центрифуге трубки стекла.
17. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
18. Передача всей супернатант в стеклянный флакон и сухой атмосфере азота.
19. Растворите липидной пленки в 500 мкл хлороформа и хранить при температуре -20 ° C.

Анализ липидов методом масс-спектрометрии

Акции смесь липидных стандартов в хлороформе должны быть подготовлены заранее, так как в таблице 1, а также исходный раствор метанола - хлороформ (1:1) с 0,1% (об. / об) гидроксида аммония.

1. До инъекции, объединить 10 мкл образца 10 мкл стандартной смеси липидов представлены в таблице 1. В 200 мкл 1:1, хлороформ: метанол с 0,1% NH ₄ OH.
   • Стандарт образца соотношение может быть изменен по мере необходимости.
2. Решение липидов использованием Micromass Q-TOF масс-спектрометр 2 оснащены нано-электрораспылением источник, работающих на скорости потока 1 мкл / мин.
   • Точные параметры инструмента будет варьироваться от инструмента к инструменту. См. Таблицу 2 для параметров Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник. Хотя мы и воспользовались высоким разрешением Q-TOF тип масс-спектрометра, это не обязательное требование.
3. После приобретения масс-спектрах сглаживаются, фон вычитается и по центру, а затем пик список экспортируется в Excel. Пиков каждого липидного класса, то нормализованные к их внутренним стандартам. В зависимости от приложения, оно может быть необходимо делать выполнения дальнейшей пост-обработки, такие как deisotoping и деконволюции.

Таблица 1. Внутренние стандарты липидов, их концентрация встандартные смеси, а режим MS для их анализа.

Таблица 2. Инструмент настройки для Micromass Q-ToF 2 (Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США), оснащенных нано-электрораспылением источник.

Этот метод позволяет быстрое количественной оценки дрожжей lipidome с помощью легко доступных, недорогих материалов. Метод позволяет идентифицировать большинство из липидных видов, обитающих в дрожжевые клетки, за исключением diacylglycerols, ergosterols и ergosteryl эфиры, хотя эти липиды могут быть идентифицированы по замене гидроксида аммония с гидроксидом лития. Описанный метод позволяет идентифицировать липидов и количественная на таких низких концентрациях, как мкг / мл, с концентрацией линейности распространяется свыше 2 до 3 порядков (в зависимости от липидного видов). Хотя соответствующие стандарты для фосфатидилинозитол не в продаже, различных молекулярных форм этого фосфолипида можно оценить, используя стандарты для других видов фосфолипидов.