Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Material und Methoden

1. Hefestämme und Wachstumsbedingungen
   Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer "Flasche Volumen / Medium Volume"-Verhältnis von 5:1 kultiviert.
2. Lagerung von Hefezellen zur Lipidextraktion
   
   1. Eine 50 ml Kultur von Zellen wurde durch Zentrifugation bei 3000 xg für 5 Minuten geerntet.
   2. Zweimal mit kaltem Wasser.
      1. Pellet in 25 ml eiskaltem Wasser
      2. Pellet-Zellen in der Zentrifuge bei 3000 xg für 5 Minuten
   3. Das Pellet und Transfer zum Eppendorf-Röhrchen
   4. Pellet durch Zentrifugation, 16.000 xg für 2 Minuten, Überstand entfernen und frieren bei -80 ° C bis zur Verwendung. (Wir verwenden ein Becherglas mit Isopropylalkohol gehalten in dem -80 Gefrierschrank, flüssigem Stickstoff können ebenfalls verwendet werden)
3. Reagenzien
   Biotech grade Chloroform und Methanol wurden von Sigma-Aldrich. Freie Fettsäuren und Triglyzeriden wurden aus Larodan (Malmö, Schweden) bezogen. Verschiedene Arten von Phospholipiden - einschließlich Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Cardiolipine - wurden von Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA) erhalten. High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen mit Teflon ausgekleideten Kappen wurden von Fisher.

Lipidextraktion

Dies ist eine Modifikation des Protokolls durch Bligh und Dyer ⁸ beschrieben. Alle Manipulationen mit extrahierten Lipide sollte mit Glas Pipetten oder Spritzen werden; Kunststoffen eine große Hintergrund-Signal zu erzeugen, wenn sie in Kontakt mit Chloroform zu kommen. Die genauen Mengen sind nicht kritisch, solange die Verhältnisse der 1:2:0.8 für Chloroform - Methanol - H ₂ O in Schritt 3 und 2:2:1.8 für Chloroform - Methanol - H ₂ O in Schritt 7 konserviert sind.

1. Resuspendieren gefrorenen Zellen in 1,6 ml eiskaltem destilliertem H ₂ O.
2. Übertragen 1,6 ml der Zellsuspension zu High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
3. Add 6 ml Chloroform und MeOH (1:2) mischen und 0,8 ml Glasperlen zur Zellsuspension.
4. Vortex die Zellsuspension mit Glasperlen zweimal für 1 min.
5. 2 ml Chloroform und vorsichtig mischen.
6. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen.
7. 2 ml destilliertem H ₂ O und vorsichtig mischen.
8. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen.
9. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
10. Sammeln Sie die gesamte flüssige Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
11. Fügen Sie 3,2 ml Chloroform auf die Zellpellets aus Schritt 9.
12. Vortex zwei Mal für 1 min.
13. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
14. Fügen Sie den Überstand in der flüssigen Phase aus Schritt 10.
15. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
16. Entsorgen Sie die obere (wässrige) Phase und übertragen Sie die untere (organische) Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen.
17. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
18. Geben Sie den gesamten Überstand in einem Glasfläschchen und trocken unter Stickstoff.
19. Lösen Sie den Lipidfilm in 500 ul Chloroform und bei -20 ° C.

Analyse von Lipiden durch Massenspektrometrie

Chloroform (1:1) mit 0,1% (v / v) Ammoniumhydroxid - Eine Aktie Mischung aus Lipid-Standards in Chloroform sollte vorher gemäß Tabelle 1 sowie einer Stammlösung von MeOH vorbereitet werden.

1. Vor der Injektion kombinieren 10 ul einer Probe mit 10 ul der üblichen Mischung von Lipiden in Tabelle 1 angegeben. In 200 ul von 1:1 Chloroform: Methanol mit 0,1% NH ₄ OH.
   • Der Standard zur Probe Verhältnis kann bei Bedarf geändert werden.
2. Resolve Lipide mit einem Micromass Q-TOF 2 Massen-Spektrometer mit einem Nano-Elektrospray-Source-Betriebssystem mit einer Flussrate von 1 ml / min ausgestattet.
   • Exact Geräteparameter wird von Instrument zu Instrument unterschiedlich sein. Siehe Tabelle 2 für die Einstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet. Obwohl wir den Vorteil der hohen Auflösung eines Q-TOF Art von Massenspektrometer aufgenommen haben, ist es nicht zwingend erforderlich.
3. Nach dem Erwerb der Massenspektren werden geglättet, Hintergrund subtrahiert und zentriert, und dann die Peak-Liste nach Excel exportiert. Die Spitzen der einzelnen Lipid-Klasse werden dann in ihre internen Standard normalisiert. Je nach Anwendung kann es notwendig sein, nicht weiter Nachbearbeitung wie deisotoping und Entfaltung führen.

Tabelle 1. Internal Lipid-Standards, deren Konzentrationen inder Standard-Mix und die MS-Modus für deren Analyse.

Tabelle 2. Geräteeinstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet.

Diese Methode ermöglicht eine schnelle quantitative Beurteilung der Hefe lipidome mit leicht verfügbaren, preiswerten Materialien. Die Methode erlaubt die Identifikation der meisten Lipidspezies in Hefezellen mit Ausnahme der Diacylglycerole, ergosterols und ergosteryl Ester gefunden, obwohl diese Lipide durch den Austausch Ammoniumhydroxid mit Lithiumhydroxid identifiziert werden kann. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie pg / ml, wobei die Konzentration Linearität die sich über 2 bis 3 Größenordnungen (abhängig von Lipid-Arten). Obwohl angemessene Standards für die Phosphatidylinositol nicht kommerziell erhältlich sind, können die verschiedenen molekularen Formen dieses Phospholipid beurteilt unter Verwendung von Standards für andere Phospholipid Spezies.