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一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

,

Department of Biology, Concordia University

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Cite this Article: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

Bourque, S. D., Titorenko, V. I. A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (30), e1513, doi:10.3791/1513 (2009).

Abstract: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

脂质是生物分子的主要类别之一，并发挥重要作用膜动力学，能量存储，和信令

Protocol: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

材料和方法

  1. 酵母菌株和生长条件。
    丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。
  2. 脂质提取的酵母细胞储存
    1. 文化是收获的细胞50毫升离心5分钟在3000 XG。
    2. 用冷水冲洗两次。
      1. 悬浮颗粒在25毫升冰水
      2. 在离心沉淀细胞，5分钟在3000 XG
    3. 悬浮颗粒和转移到Eppendorf管
    4. 球离心，16000 XG 2分钟，取出使用上清于-80 ° C，直到和冻结。 （我们使用异丙醇的烧杯中，也可以用液态氮保存在-80冷冻）
  3. 试剂
    自Sigma - Aldrich生物技术级氯仿和甲醇。游离脂肪酸和甘油三酯均购自Larodan（瑞典马尔默）。获得各种种磷脂 - 包括磷脂，磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，并cardiolipins - 阿凡提极性脂（雪花石膏，AL，美国）。从费舍尔高速离心管玻璃与聚四氟乙烯内衬的盖子。

脂质提取

这是一个布莱和代尔8所述的协议的修改。提取血脂所有的操作，应使用玻璃移液管或注射器，塑料将创建一个大的背景信号，如果他们接触到，以氯仿。确切的卷是不是只要关键氯仿的比例为1:2:0.8 -甲醇-在第3步中的H 2 O和2:2:1.8为氯仿-甲醇- H 2 O在第7步是保守的。

  1. 冷冻细胞重悬在1.6毫升的冰冷的蒸馏水H 2 O
  2. 1.6毫升细胞悬液转移到高速的玻璃离心管。
  3. 加入6毫升氯仿和甲醇（1:2）混合和0.8毫升细胞悬液的玻璃珠。
  4. 涡细胞悬液，用玻璃珠1分钟的2倍。
  5. 加入2毫升氯仿，轻轻混匀。
  6. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
  7. 加入2毫升的蒸馏水H 2 O，轻轻混匀。
  8. 孵育5分钟室温搅拌偶尔。
  9. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  10. 整个液相收集到一个新的高速玻璃离心管。
  11. 从第9步的细胞沉淀，加入3.2毫升氯仿。
  12. 涡1分钟两次。
  13. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  14. 从第10步液相添加上清。
  15. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  16. 倒掉上层（水）相和较低的阶段（有机）转移到一个新的高速玻璃离心管。
  17. 在3000 XG在室温下5分钟离心。
  18. 整个上清转移到一个玻璃小瓶，干燥的氮气保护下。
  19. 脂质膜溶解于500μL氯仿和储存在-20 ° C

质谱分析血脂

血脂标准的股票组合中的氯仿应事先准备好的，按表1，以及原液的甲醇 - 氯仿（1:1）0.1％（V / V）氢氧化铵。

  1. 注射前，结合10μL在表1提供的血脂标准混合样品10μL。在200μL1:1的氯仿：甲醇与0.1％NH 4 OH。
    • 样本比例的标准是可以改变的需要。
  2. 解决使用一个微团的Q - TOF质谱仪配备与1μL/ min的流速在纳米电源经营血脂。
    • 从仪器仪表精确的仪器参数会有所不同。一个微团配备一个纳米电源2 Q - TOF（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的设置，请参阅表2。虽然我们已采取的Q - TOF质谱仪的一个类型的高分辨率的优势，它不是一种强制性要求。
  3. 收购后的质谱是平滑的，减去背景和中心，然后高峰列表导出到Excel。每个脂质类的峰值，然后归到他们的内部标准。根据不同的应用，它可能需要做进行进一步处理后deisotoping和反褶积等。

表1。内部血脂标准，其浓度标准的组合，并为他们的分析MS模式。

脂质类标准链的构成标准的质量浓度（微克/毫升） MS模式
磷脂酸 14:0 / 14:0 591.40 100 负面
磷脂酰乙醇胺 14:0 / 14:0 634.45 200 负面
磷脂 N / A N / A N / A 负面
磷脂 14:0 / 14:0 622.37 40 负面
心磷脂 4x14：0 619.92 100 负面
游离脂肪酸 19:0 297.28 100 负面
卵磷脂 14:0 / 14:0 650.48 100 积极的
甘油三酯 13:0 / 13:0 / 13:0 698.63 200 积极的

表2。一个微团Q - TOF 2（沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国）的仪器设置配备纳米电源。

流量锥孔电压毛细管电压碰撞气体
正离子模式 1μl/min -28 v 3.0 KV 10
负离子模式 1μl/min 30 V -3.2 KV 10

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Discussion: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

这种方法使酵母lipidome使用现成的，廉价的材料的快速定量评估。该方法允许大部分diacylglycerols，ergosterols和ergosteryl酯的例外在酵母细胞中发现的脂质物种的鉴定，虽然这些脂质可取代氢氧化锂，氢氧化铵确定。所描述的方法可低至微克/毫升的浓度脂质识别和量化，与浓度的线性超过2〜3个数量级（脂质种而定）的蔓延。虽然市售磷酸肌醇的适当的标准，本磷脂不同的分子形式可以使用其他磷脂物种的标准进行评估。

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Disclosures: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

Acknowledgements: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

我们非常感谢阿兰特西尔宝贵的建议，讨论和技术支持。我们承认在Concordia大学生物应用质谱杰出服务中心。这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席，细胞生物学和老化。

References: 一个定量评估的酵母使用电喷雾质谱法Lipidome

  1. Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J.R., Wiest, M.M., Watkins, S.M. & Hotamisligil, G.S. Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell 134, 933-944 (2008).
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