Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Materiali e metodi

1. Ceppi di lievito e le condizioni di crescita
   Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto "fiasco volume / medio volume" di 5:1.
2. Stoccaggio di cellule di lievito per l'estrazione dei lipidi
   
   1. Una cultura da 50 ml di cellule è stato raccolto per centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti.
   2. Lavato due volte con acqua fredda.
      1. Risospendere il pellet in 25 ml di acqua ghiacciata fredda
      2. Cellule pellet in centrifugare a 3000 xg per 5 minuti
   3. Risospendere il pellet e trasferimento a tubo eppendorf
   4. Pellet per centrifugazione, 16.000 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante e congelare a -80 ° C fino al momento dell'uso. (Usiamo un bicchiere di alcool isopropilico conservati nel congelatore -80, azoto liquido può essere utilizzato anche)
3. Reagenti
   Biotech cloroformio grado e metanolo sono da Sigma-Aldrich. Acidi grassi liberi e trigliceridi sono stati acquistati dalla Larodan (Malmö, Svezia). Varie specie di fosfolipidi - tra cui fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, acido fosfatidico e cardiolipins - sono stati ottenuti da lipidi Avanti Polar (Alabastro, AL, USA). Ad alta velocità centrifuga tubi di vetro con tappo rivestito in teflon sono stati da Fisher.

Estrazione dei lipidi

Si tratta di una modifica del protocollo descritto da Bligh e Dyer ^8. Tutte le manipolazioni con i lipidi estratto deve essere fatto utilizzando siringhe o pipette di vetro, plastica crea un segnale di grande fondo se entrano in contatto con il cloroformio. I volumi esatte non sono critiche fino a quando i rapporti di 1:2:0.8 per il cloroformio - MeOH - H ₂ O al punto 3 e 2:2:1.8 per il cloroformio - MeOH - H ₂ O al punto 7 sono conservati.

1. Risospendere le cellule congelate in 1,6 ml di ghiacciata distillata H ₂ O.
2. Trasferire 1,6 ml di sospensione cellulare di tubi di vetro ad alta velocità centrifuga.
3. Aggiungere 6 ml di cloroformio e MeOH (1:2) e miscelare 0,8 ml di perline di vetro alla sospensione cellulare.
4. Vortex la sospensione cellulare con perle di vetro due volte per 1 minuto.
5. Aggiungere 2 ml di cloroformio e mescolare delicatamente.
6. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione occasionali.
7. Aggiungere 2 ml di H ₂ O distillata e mescolare delicatamente.
8. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione occasionali.
9. Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
10. Raccogliere tutta la fase liquida in una nuova ad alta velocità, tubo di vetro per centrifuga.
11. Aggiungere 3,2 ml di cloroformio al pellet cellulari dal punto 9.
12. Vortex due volte per 1 minuto.
13. Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
14. Aggiungere il sopranatante in fase liquida a partire dal punto 10.
15. Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
16. Eliminare il superiore (acquosa) di fase e il trasferimento inferiore (organici) in una nuova fase alta velocità tubo di vetro per centrifuga.
17. Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
18. Trasferire il surnatante in un intero flacone di vetro e secco sotto azoto.
19. Sciogliere il film lipidico in 500 ml di cloroformio e conservare a -20 ° C.

Analisi dei lipidi mediante spettrometria di massa

Un mix stock di standard di lipidi in cloroformio deve essere preparato in anticipo come da tabella 1, così come una soluzione stock di MeOH - cloroformio (1:1) con il 0,1% (v / v) di idrossido di ammonio.

1. Prima dell'iniezione, unire 10 ml di un campione con 10 microlitri della miscela standard di lipidi riportate nella Tabella 1. In 200μL di 1:1 cloroformio: metanolo con 0,1% di NH ₄ OH.
   • Lo standard di rapporto di campione possono essere modificati se necessario.
2. Risolvere i lipidi con un Q-TOF Micromass 2 spettrometro di massa dotata di un nano-elettrospray operativi di fonte ad un flusso di 1 ml / min.
   • Parametri dello strumento esatta varia da strumento a strumento. Vedere la Tabella 2 per le impostazioni di un Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) dotata di un nano-elettrospray fonte. Anche se abbiamo sfruttato l'alta risoluzione di un Q-TOF tipo di spettrometro di massa, non è un requisito obbligatorio.
3. Dopo l'acquisizione degli spettri di massa vengono smussate, sfondo sottratto e centrato, e quindi l'elenco picco esportati in Excel. I picchi di ogni classe dei lipidi vengono poi normalizzate ai loro standard interno. A seconda dell'applicazione, può essere necessario fare eseguire ulteriori post-elaborazione, come deisotoping e deconvoluzione.

Lipidici standard Tabella 1. Interno, la loro concentrazione inil mix standard, e la modalità MS per la loro analisi.

Tabella 2. Impostazioni dello strumento per una Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) dotata di un nano-elettrospray fonte.

Questo metodo consente una rapida valutazione quantitativa del lipidome lievito utilizzando prontamente disponibili, materiali poco costosi. Il metodo permette l'identificazione della maggior parte delle specie di lipidi si trovano in cellule di lievito con l'eccezione di diacilgliceroli, ergosteroli ergosteryl ed esteri, anche se questi lipidi possono essere identificati sostituendo idrossido di ammonio e di idrossido di litio. Il metodo descritto permette l'identificazione e quantificazione dei lipidi alle concentrazioni più basso mg / ml, con la linearità concentrazione diffusione nell'arco di 2 o 3 ordini di grandezza (a seconda della specie lipidico). Sebbene gli standard appropriati per fosfatidilinositolo non sono disponibili in commercio, le diverse forme molecolari di questo fosfolipidi possono essere valutati utilizzando standard per le specie di fosfolipidi altri.