ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

הפרוצדורות שכן electroporation vivo של השרירים FDB ו IO

1. לפני תחילת בפרוטוקולים vivo electroporation, פלסמידים ביטוי יונקים יש ריכוז מוגבר להניב בטווח של עד 2-5 מיקרוגרם הערה פלסמיד / μl של TE:. אנו משתמשים באופן שגרתי ערכות הגברה מסחרית בצע את ההליכים של היצרן. ביטוי מסחרי פלסמידים הנושאים את העבודה האמרגן CMV היטב בשרירי השלד ב transfections vivo.
2. נפח Aliquot הצורך (1-20 μl) של הפתרון פלסמיד ולשמור אותו בשתי 0.5 מ"ל Eppendorf צינורות (אחד עבור כל רגל של העכבר).
3. הכן תמיסה המכילה 2 מ"ג / מ"ל ​​hyaluronidase ב Tyrode סטרילית.
4. שימוש בתיבת הרדמה, עמוק להרדים בעכבר באמצעות 4% isoflurane ב O2 עם מכונת אושרה גז הרדמה. מניחים את חיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) ולשמור על הרדמה באמצעות מסיכת פנים מכרסמים. צג את עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן.
5. תחת התבוננות במיקרוסקופ לנתיחה, להזריק 10 μL הפתרון hyaluronidase מתחת לכפות הרגלים של רגל אחת על העכבר בעזרת 1 "מחט ארוכה 33 מד סטרילית. לחדור את העור בנקודה קרוב לעקב כף הרגל ולקדם את מחט תת עורית לעבר בסיס של אצבעות על ~ 1 / 4 ".
6. חזור על התהליך עם הרגל השנייה אם רוצים כל כך.
7. נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה.
8. לאחר שעה, להרדים את החיה בפעם השנייה והנח אותו על משטח חימום. בעקבות ההליך אותו תיאר לפתרון hyaluronidase, להזרים סכום של 20-50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (תלוי בגודל של לבנות את הפלסמיד). נפח הזרקה בסך הכל צריך להיות פחות מ 20 μL / רגל. הערה: כאשר L μ 15-20 הכרחי, מומלץ לסגור את העור בנקודת הכניסה מחט עם דבק רקמות.
9. נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה ולחכות 10-15 דקות.
10. להרדים את החיה בפעם השלישית ולמקם אותו על משטח חימום.
11. בחר רגל אחת של החיה. מקום אחד מצופה זהב דיקור מחט מתחת לעור בעקב, ואת השני בבסיס הבהונות. אלקטרודות מקבילים בכיוון אחד את השני בניצב לציר הארוך של כף הרגל.
12. חבר את ראש מחטים (אלקטרודות) כדי ממריץ החשמל באמצעות מיקרו קליפ מחברים. Electroporate את השרירים על ידי החלת פולסים 20, 20 מילישניות משך / כל אחד, בכל 1Hz. בהתאם המרווח של האלקטרודות, משרעת מתח "פולסים מותאם (על ידי ניטור עם אוסצילוסקופ) להניב שדה חשמלי של הערה ~ 100 V / cm:. התכווצויות לא כתגובה לגירויים יש לשים לב אם רמת הרדמה היא נאותה.
13. אם תרצה כך, חזור על התהליך המתואר לעיל ברגל הנגדי של החיה.
14. מחזירים את החיה לכלוב שלה התאושש לחלוטין מן ההרדמה פעם לשמור את זה תחת השגחה. הערה: אם ההליך המשיך כרגיל, החיה צריכה להחזיר ניידות מלאה בתוך 30 דקות ולאחר מכן הוא מוכן להישלח בחזרה לחדר חיה בבית ביבר. זריקות של hyaluronidase ו-DNA לכפות הרגלים אין תופעות לוואי מורגש על בעלי החיים. התאושש לאחר מההרדמה, עכברים מסוגלים בנחת בדרך כלל סביב הכלוב. כאמצעי זהירות נוסף, להוסיף למי השתייה של Carprofen החיה ב 0.0027 מ"ג / מ"ל ​​במשך 2 ימים כמשכך כאבים.
15. ביטוי חלבון יכול להיות assayed 2-8 ימים לאחר transfection. עם זאת, ביטוי מתמשך של חלבונים רבים נצפתה במשך חודשים.

הערה: כל הנהלים חיה אושרו על ידי ועדת הקנצלר של UCLA Animal Research כמו המנדט על ידי חוק לרווחת בעלי חיים ומדיניות PHS על טיפול השתמש ההומאנית של חיות מעבדה.

נציג תוצאות:

יישום נכון של תהליכי vivo electroporation שתוארו לעיל צריך לגרום transfection יעיל של פלסמידים בשרירים FDB ו Io. עם זאת, היעילות של הביטוי של וריאנטים חלבון מהונדס יהיה תלוי פלסמיד, את גודל ואת המורכבות של החלבון, את המאפיינים תפקודית של חלבון, וכן מספר משתנים אחרים מחוץ לשליטתנו. כמו באיור 1 של שריר FDB electroporated בנוכחות קידוד מסחרי (PMR-mCherry) פלסמיד לחלבון mCherry, רוב סיבי השריר הם transfected עם פרוטוקול שלנו כפי שמודגם על ידי העובדה שרובם להציג פלואורסצנטי אדום. זה אינו פוסל את האפשרות כי סיבים בודדים התערוכה דרגות שונות של ביטוי חלבון, או סיבים מעטים אינם transfected בכלל 3. יש בדואר ציין כי ביטוי יעיל של כמויות גדולות של חלבוני ניאון כגון mCherry, EGFP, ECFP ו EYFP, אינו פוגע רגישות סיבי "עירור שרירים, התכווצות נכסים צימוד. למעשה, הם נבדלים אלה השרירים דמה transfected (תוצאות לא מוצג).

גישות מעשיות להשתמש כדי לאמת את ביטוי מקומי של חלבונים fluorescently-tagged בתוך סיבי שריר השלד.

לוקליזציה תאיים של חלבונים די נובו מהונדס הביע מוערך באופן שגרתי על ידי רכישת סימולטני, באמצעות, TPLSM תמונות הניאון של התגים ותמונות בהתאמה של סמנים היטב לזהות מבנים הסלולר. הטיפוסי ביותר של אלה האחרונים הם:) שנית הרמוני (SHG) דור תמונות, אשר נובעים אנאיזוטרופיה שרירן sarcomeric של להקות (מרוכז ב-M-lines) 9,10 ו, ב) di-8-ANEPPS פלואורסצנטי תמונות, אשר ניתן להשיג על ידי תיוג את פני השטח רוחבי צינורי (T-אבובית) מערכת הממברנות של סיבי השריר עם dye11 זה פוטנציומטרית impermeant. בתמונות הקרינה של סיבי שריר מוכתם di-8-ANEPPS, T-tubules יופיעו להקות הצר של הקרינה בכיוון מאונך כ על ציר זמן של סיבים. להקות אלו רווח שווה זה מזה: הם מופרדים על ידי מרחק רב אשר משתרע על פני ה-M-שורות קצרה כי משתרע על פני ¹¹ Z-line.

הביטוי לוקליזציה של α-actinin-EGFP בתוך סיבי שריר השלד.

דוגמה לביטוי של גרסה מתויג של חלבון השריר מבניים α-actinin מוצג באיור 2. חלבון זה נקרא להיות מרכיב מרכזי של קו-Z, וככזה, הוא משמש באופן שגרתי כסמן של structure12 זה. אנו transfected השרירים FDB ו IO עם קידוד pEGFPN1-α-actinin1 פלסמיד עבור (שרירים שאינם) אדם α-actinin מתויג בטרמינל C עם EGFP. שישה ימים לאחר transfection, מצאנו כי, כפי שנבחנו על ידי חלוקת הקרינה EGFP, α-actinin מתבטאת בעיקר להקות צר ברווחים שווים לאורך ציר סיבים. להקה אחת לכל sarcomere נתפסת (איורים 2A & 2D). Colocalization של להקות אלה עם ה-Z קווי מודגם על ידי השוואת התפלגות EGFP פלואורסצנציה עם SHG (תרשים 2B) ו di-8-ANEPPS (2E איור) תמונות. כפי שמוצג על ידי התמונה כיסוי (איור 2C), α-actinin-EGFP להקות חלופי עם להקות SHG, המציין כי הם נמצאים באמצע הדרך בין שני M-להקות ברציפות, בד בבד עם המיקום של Z-הקווים. בתוך סיבי השריר transfected מוכתם di-8-ANEPPS, α-actinin-EGFP להקות נראים מרוכז בין כל זוג של T-tubules (תרשים 2F) אשר ידועים האגף קווי Z (כלומר מופרדים על ידי מרחק קצר), וכך המציין כי מהונדס α-actinin מיועד קו-Z.

הביטוי של DHPRα1s מתויג בתחנה הסופית-N עם EGFP

היעילות של transfection שריר עם pEGFPC1.1 DHPR α-1s מאומת בתמונות TPLSM (למשל איור 3A) מראה כי רוב הסיבים להביע EGFP-DHPRα1s (חלבון הטרנסממברני). התכונה הבולטת ביותר של סיבים transfected הוא דפוס פעמיים חברו של EGFP פלואורסצנטי (איורים 3A & 3B) כפי שניתן היה לצפות, אם זה היה ממוקד חלבון ה-T tubules. זה יכול להיות גם ציין באיור 3 כי בעוד סיבים שונים להציג רמות שונות של עוצמת הקרינה, את דפוס הקרינה התאגדו של סיבים בודדים נראה להישמר הומוגנית לאורך הסיב. בהגדלה גבוהה יותר (איור 3 ב), ניתן לראות בבירור כי ריווח אחיד בין להקות דומה לזה שנצפה סיבים מוכתם di-8-ANEPPS (למשל 2E איור). התמונות כיסוי (איור 3B & 3E) להמחיש כי להקות SHG נמצאים בתוך המרווח הגדול בין EGFP-DHPRα1s להקות, אישרו כי החלבון הזה ב-T-tubules. מדידות נוספות סריג עם אניון לא פלורסנט lipophilic-DPA (מידע לא מוצג) נוספים מראים כי מחצית EGFP בתוך ננומטרים ספורים של העלון הפנימי של קרום של T-tubules.

לוקליזציה והערכה תפקודית של הביטוי של EYFP-ClC1

סיבים transfected עם pEYFP-ClC1, המקודד לבנות EYFP-tagged (ב-N טרמינל) של ערוץ כלוריד שרירי השלד (ClC1), להציג EYFP להקות פלואורסצנטי (איור 4A) עם דפוס דומה לזה שנצפה עבור EGFP-DHPRα1s "הביטוי (איור 3A) ו המקביל להסדר T-אבובית כמו מאויר עם מכתים di-8-ANEPPS (2E איור). כצפוי, אימפוזיציה של EYFP-ClC1 (איור 4A) ותמונות SHG (איור 4B) כפי שמוצג כיסוי (איור 4C), ממחישות כי להקות SHG מרוכזים על ריווח גדול of בין להקות EYFP פלואורסצנטי.

על מנת להעריך האם הבעת EYFP-ClC1 תוצאות לעלייה משמעותית מוליכות המנוחה של סיבי השריר, כצפוי מ overexpression של תעלות כלוריד פונקציונלי, אנו סיבי השריר enzymatically ניתק מן השריר FDB transfected ולמד תכונות אלקטרו שלהם באמצעות שתי microelectrodes ההתקנה הניסוי שתואר לעיל ^6,11,13. איור 5 מציג תוצאות משני סיבים: אחד להביע את כמויות גדולות של EYFP-ClC1 כפי שהוערכו מן העולמי מדידות עוצמת הקרינה מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל (לא מוצג), והשני הוא פקד שאינו transfected. שיא המתח באיור 5A (המתקבל סיבי השריר להביע EYFP-ClC1) מוכיח כי בשל מוליכות המנוחה מוגזם, סיבים הוא כמעט ולא להתרגש. פולסים גירוי מקומי של עד 400nA (0.5ms) צריך לשמש כדי לעורר תגובה פעיל מאוד קטנה (לא, להחטיא את המטרה 5A איור). לאחר החלפת הפתרון Tyrode חיצוני אחד המכיל 500 מיקרומטר של חוסם כלוריד ערוץ 9-ACA, 200 פעימות NA הנוכחית הספיקו כדי לעורר פוטנציאל פעולה (איור 5 ב), אם כי איטי יותר ורחב יותר מאלו שנרשמו סיבים הביקורת ( איור 5 ג). כצפוי, תוספת של 9-ACA הייתה השפעה מינימלית על סיבים שליטה זו (איור 5D).

באיור 1. Transfection היעילות של השיטה ב-vivo electroporation. Brightfield (א) ו פלואורסצנטי (ב ') תמונות של שריר FDB transfected עם mCherry-PMR. ימים לאחר פרוטוקול electroporation: 12 ימים. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. הביטוי המיקוד של α-actinin-EGFP בסיבים FDB. פאנלים A ו-B הם פלואורסצנציה EGFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע α-actinin-EGFP. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות ב A ו B. פאנלים D ו-E הם תמונות פלואורסצנציה של סיבים אחרת להביע α-actinin-EGFP ומוכתמת עם di-8-ANEPPS, בהתאמה. לוח F היא סופרפוזיציה של תמונות D ו E. ימים לאחר electroporation פרוטוקול: 6 ימים.

איור 3. הביטוי המיקוד של EGFP-DHPRα1s בסיבים FDB. לוח א ', תמונה EGFP הקרינה של קבוצת סיבים להביע EGFP-DHPRα1s. לוח ב 'הוא הגדלה של הריבוע בלוח כדי להראות טוב יותר את הדפוס התאגדו ביטוי החלבון. לוח C הוא דמות SHG המתאימים לדימוי בלוח לוח א D הוא כיסוי של תמונות ו-C פאנל E הוא הגדלה של אזור המצוין ימים פאנל ד לאחר פרוטוקול electroporation: 20 ימים.

איור 4. הביטוי המיקוד של EYFP-ClC1 בסיבים FDB. לוחות A ו-B הם פלואורסצנציה EYFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע EYFP-ClC1. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות לוחות A ו-B פאנל D הוא פרופיל העוצמה נמדדת לאורך קו לבן מסומן בתמונה בימים פאנל C. לאחר פרוטוקול electroporation: 7 ימים.

איור 5. סיבים אלקטרו להביע הערכה מהונדס EYFP-ClC1. פאנלים A ו-B הן רשומות מתח מ סיבים להביע EYFP-ClC1 בתגובה פולסים הנוכחית לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה. לוחות C ו-D רשומות מתח (פוטנציאל פעולה) שהושרו בתגובה פולסים הנוכחית סיבים שאינם transfected לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה.

אנו מתארים כאן את הצעדים מפורט כי יש לפעול כדי להשיג transfections יעיל של פלסמידים DNA לתוך סיבי שריר השלד על ידי electroporation ב vivo. היתרונות העיקריים של הגישה שלנו הן את הפשטות של היישום, הפולשנות שלו מינימלית שתוצאתה סיכון בריאותי זניח לבעלי החיים. במציאות, פרוטוקולים מעל electroporation תיאר שאינן כרוכות הרבה יותר מאשר שתי זריקות תת עורית למטר, ואחריו פרוטוקול גירוי חשמלי, כל אלה הם נסבל היטב על ידי בעלי חיים תחת הרדמה. במוסד שלנו מניפולציות אלה נקבעים להיות לגמרי לא ניתוחי הליכים מאז הם לא לערב הפתיחה של העור. חוץ מזה, רכות ההליכים electroporation מהווה גורם קריטי להצלחה הכוללת בהשגת transfection פלסמיד יעיל ביטוי חלבון לאחר מכן על ידי סיבי שריר מאז נזק משמעותי תא תפגע ביכולת שלהם ביעילות לעסוק סינתזת חלבון פעיל.

שינויים קלים הנהלים המתואר כאן ניתן (ולא היה) מיושם על השרירים הגדולים של כף הרגל העכבר (למשל extensor digitorum longus, אדי; tibialis הקדמי, ת"א; ו, השרירים soleus). יתר על כן, רק על ידי דרוג את הסכום הכולל של ה-DNA, יישמנו את הנהלים המדויקים שתוארו כאן כדי transfect FDB ו IO השרירים של חולדות למבוגרים עם הצלחה גדולה.

אף על פי פרוטוקולים transfection בעקביות תוצאה ברמה משתנה של ביטוי של חלבונים מהונדס ידי סיבי השריר, זה יכול להיות ניצלו בניסויים פיזיולוגיים, שאינם להביע סיבים יכול לשמש פקדים סיבים עם רמה שונה של ביטוי יכול לשמש כדי לתאם את רמת הביטוי לרמת לשנות לתפקד. כמו כן, היזמים CMV נמצאו להיות מתאים מניב רמות גבוהות של ביטוי חלבון, אחרים ספציפיים שריר היזמים עשוי לשפר את היעילות של ביטוי חלבון. יצוין, כי כאשר אין אפשרות (או נוח) להביע את החלבון בונה fluorescently-tagged בסיבי השריר, הצלחנו לבטא חלבונים לא מתוייגת ולנטר את רמת הביטוי פלסמידים bicistronic כי במקביל לקודד חלבון פלואורסצנטי.