Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

Le procedure sperimentali per elettroporazione in vivo dei muscoli FDB e IO

1. Prima di avviare il protocollo di elettroporazione in vivo, i plasmidi di espressione mammifero deve essere amplificato per produrre la concentrazione nel range di 2-5 mg al Nota plasmide / l di TE:. Rotazione abbiamo utilizzare i kit di amplificazione commerciale e seguire le procedure del produttore '. Plasmidi di espressione commerciale portando il lavoro di promotore CMV, molto bene nel muscolo scheletrico in trasfezioni vivo.
2. Aliquota il volume necessario (10-20 mL) della soluzione di plasmide e salvarlo in due provette Eppendorf da 0,5 ml (una per ogni piede del mouse).
3. Preparare una soluzione contenente 2 mg / ml di ialuronidasi in Tyrode sterile.
4. Utilizzando una scatola anestetizzare, profondamente anestetizzare un mouse utilizzando 4% isoflurano in O2 con una macchina approvata gas anestetico. Mettere l'animale su una piastra elettrica (37 ° C) e mantenere l'anestesia utilizzando una maschera di roditori. Monitorare la profondità dell'anestesia per riflesso dito pizzico.
5. Sotto osservazione con un microscopio dissezione, iniettare 10 ml di soluzione ialuronidasi sotto pastiglie dei piedi di un piede del mouse utilizzando un 1 "lungo 33 ago sterile calibro. Penetrare la pelle in un punto vicino al tallone del piede e far avanzare l'ago per via sottocutanea verso la base delle dita dei piedi per ~ 1 / 4 ".
6. Ripetere la procedura con l'altro piede, se lo si desidera.
7. Scollegare l'anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente l'anestesia.
8. Dopo un'ora, anestetizzare l'animale per la seconda volta e mettetelo sulla rampa di riscaldamento. Seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione ialuronidasi, iniettare un totale di 20-50 mg di DNA plasmidico (a seconda delle dimensioni del costrutto plasmide). Il volume di iniezione totale dovrebbe essere inferiore a 20 microlitri / piedi. Nota: quando L μ 15-20 è necessario, è consigliabile chiudere la pelle nel punto di entrata dell'ago con il tessuto-colla.
9. Scollegare l'anestesia e posizionare il mouse in una gabbia. Permettergli di recuperare pienamente da anestesia e attendere per 10-15 minuti.
10. Anestetizzare l'animale per la terza volta e posizionarlo sulla rampa di riscaldamento.
11. Seleziona un piede dell'animale. Posizionare un placcati in oro aghi dell'agopuntura sotto la pelle al tallone, ed un secondo alla base delle dita dei piedi. Gli elettrodi sono orientate parallelamente tra loro e perpendicolari all'asse lungo del piede.
12. Collegare il capo degli aghi (elettrodi) allo stimolatore elettrico utilizzando micro-clip connettori. Electroporate i muscoli mediante l'applicazione di 20 impulsi, 20 ms di durata / cad, a 1Hz. A seconda della distanza degli elettrodi, gli impulsi di ampiezza della tensione 'è regolata (attraverso il monitoraggio con un oscilloscopio) per generare un campo elettrico di circa 100 Nota V / cm. Nessun contrazioni in risposta agli stimoli devono essere osservate se il livello di l'anestesia è adeguata.
13. Se lo si desidera, ripetere le procedure sopra nel piede controlaterale dell'animale.
14. Rispedire l'animale verso la sua gabbia e una volta completamente ripreso dall'anestesia mantenerlo sotto osservazione. Nota: se il procedimento è andato normalmente, l'animale deve riacquistare la piena mobilità entro 30 minuti e poi è pronto per essere inviato di nuovo alla stanza animale presso il vivaio. Le iniezioni di ialuronidasi e del DNA in pastiglie dei piedi non hanno evidenti effetti negativi sugli animali. Una volta recuperato l'anestesia, i topi sono in grado di passeggiare normalmente intorno alla gabbia. Come precauzione aggiuntiva, aggiungere l'acqua potabile del Carprofen animale a 0,0027 mg / ml per 2 giorni come analgesico.
15. Espressione della proteina possono essere analizzati 2-8 giorni dopo la transfezione. Tuttavia, l'espressione costante di molte proteine ​​è stato osservato per mesi.

NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato degli animali del Cancelliere UCLA di ricerca come previsto dalla legge sulla protezione degli animali e la politica PHS sulla cura umanitaria ed uso di animali da laboratorio.

Rappresentante dei risultati:

La corretta attuazione delle procedure di elettroporazione in vivo sopra descritto dovrebbe comportare la trasfezione di plasmidi efficace nei muscoli FDB e IO. Tuttavia, l'efficienza di espressione di proteine ​​transgeniche varianti dipenderà il plasmide, la dimensione e la complessità delle proteine, le proprietà funzionali della proteina, e una serie di altre variabili fuori dal nostro controllo. Come illustrato nella figura 1 per un muscolo FDB elettroporate in presenza di un plasmide commerciale (PMR-mCherry) che codifica per la proteina mCherry, la maggior parte delle fibre muscolari sono transfettate con il nostro protocollo, come illustrato dal fatto che la maggior parte di loro mostra fluorescenza rossa. Questo non esclude la possibilità che le singole fibre presentano diversi gradi di espressione della proteina, o che le fibre non sono pochi transfettate in tutti e 3. Dovrebbe be ha osservato che l'espressione efficiente di grandi quantità di proteine ​​fluorescenti come mCherry, EGFP, ECFP e EYFP, non mettere in pericolo l'eccitabilità delle fibre muscolari 'ed eccitazione-contrazione proprietà di accoppiamento. In realtà, essi sono indistinguibili da quelli nei muscoli farsa transfettate (risultati non mostrati).

Approcci pratici utilizzati per verificare l'espressione di proteine ​​localizzate fluorescente-tag nelle fibre muscolari scheletriche.

La localizzazione intracellulare del novo di proteine ​​espresse transgenici è regolarmente valutata dal simultanea acquisizione, utilizzando la, le immagini TPLSM fluorescente dei tag rispettivi e le immagini dei marcatori ben identificato di strutture cellulari. Il più tipico di questi ultimi sono: a) generazione di seconda armonica (SHG) immagini, che nascono dalla anisotropia miosina del sarcomero A bande (centrata sulla M-linee) e 9,10, b) di-8-ANEPPS fluorescenza immagini, che può essere ottenuta con l'etichettatura e la superficie trasversale tubolare (T-tubulo) sistema delle membrane delle fibre muscolari con questo dye11 impermeant potenziometrica. Nelle immagini a fluorescenza delle fibre muscolari colorati con di-8-ANEPPS, il T-tubuli appaiono come bande strette di fluorescenza orientata circa ortogonale all'asse lungo della fibra. Queste bande sono inegualmente distanziati gli uni dagli altri: sono separate da una distanza lunga che si estende in tutto il M-linee e uno corto che si estende in tutta la linea ^Z-11.

Espressione e localizzazione di α-actinina-EGFP nelle fibre muscolari scheletriche.

Un esempio di espressione di una variante tag della proteina strutturale del muscolo α-actinina è illustrato nella figura 2. Questa proteina è nota per essere una componente importante della Z-line e, come tale, è normalmente utilizzato come marcatore di questa structure12. Noi transfettate muscoli FDB e IO con il plasmide pEGFPN1-α-actinin1 codifica per l'uomo (non-muscolare) α-actinina tag al terminal C con EGFP. Sei giorni dopo la transfezione, abbiamo scoperto che, valutata dalla distribuzione EGFP fluorescenza, α-actinina è in gran parte espressa a bande strette equidistanti lungo l'asse della fibra. Una banda per singolo sarcomero è visto (figure 2A e 2D). La colocalizzazione di queste bande con la Z-linee è dimostrato dal confronto tra la distribuzione della fluorescenza EGFP con l'SHG (Figura 2B) e di-8-ANEPPS (Figura 2E) immagini. Come mostrato dall'immagine sovrapposizione (Figura 2C), α-actinina-EGFP band si alternano con le bande SHG, indicando che si trovano a metà strada tra due consecutivi M-band, in coincidenza con la posizione di Z-linee. Nelle fibre muscolari transfettate colorati con di-8-ANEPPS, α-actinina-EGFP bande sono visti centrate tra ogni coppia di T-tubuli (fig. 2F) che sono noti a fianco le linee Z (cioè separati da una distanza più breve), indicando così che transgenico α-actinina è rivolto a Z-line.

Espressione di DHPRα1s tag al N-terminale con EGFP

L'efficienza di trasfezione muscolari con pEGFPC1.1 DHPR α-1s è verificata nelle immagini TPLSM (ad esempio Figura 3A) che mostra che la maggior parte delle fibre esprimere EGFP-DHPRα1s (una proteina transmembrana). La caratteristica più importante di fibre trasfettate è il doppio fasciato pattern di fluorescenza EGFP (Figure 3A e 3B), come ci si aspetterebbe se questa proteina è stato mirato al T-tubuli. Può anche essere osservato in Figura 3 che, mentre le fibre diverse visualizzare diversi livelli di intensità di fluorescenza, il modello a bande di fluorescenza di una singola fibra sembra essere mantenuta omogenea lungo la fibra. A maggiore ingrandimento (Figura 3B), si può chiaramente vedere che la spaziatura irregolare tra bande è simile a quello osservato in fibre colorate di-8-ANEPPS (es. Figura 2E). Le immagini sovrapposte (Figura 3B e 3E) mostrano che le bande SHG si trovano all'interno della più ampia spaziatura tra EGFP-DHPRα1s band, che conferma che questa proteina è al T-tubuli. Ulteriori misure di FRET con la non-fluorescenti anione lipofili DPA-(dati non riportati) dimostrano inoltre che la porzione EGFP si trova pochi nanometri del foglietto interno della membrana del T-tubuli '.

Localizzazione e valutazione funzionale dell'espressione di EYFP-ClC1

Fibre transfettate con pEYFP-ClC1, che codifica per una costruzione EYFP-tag (al N-terminale) del canale cloruro muscolo scheletrico (ClC1), display EYFP bande di fluorescenza (Figura 4A) con un modello simile a quello osservato per EGFP-DHPRα1s 'espressione (Figura 3A) e corrispondente al T-tubulo intese come illustrato con colorazione di-8-ANEPPS (2E Figura). Come previsto, la sovrapposizione di EYFP-ClC1 (Figura 4A) e le immagini SHG (Figura 4B), come mostrato nella sovrapposizione (Figura 4C), mostrano che le bande SHG sono centrati, alle distanze o di grandi dimensionif EYFP tra bande di fluorescenza.

Al fine di valutare se l'espressione di EYFP-ClC1 si traduce in un significativo aumento della conduttanza di riposo delle fibre muscolari, come previsto dalla sovraespressione di canali del cloro funzionale, abbiamo fibre muscolari enzimaticamente dissociato dal muscolo FDB transfettate e studiato le loro proprietà elettrofisiologiche utilizzando due microelettrodi sperimentale descritto in precedenza ^6,11,13. La Figura 5 mostra i risultati di due fibre: uno che esprime una grande quantità di EYFP-ClC1 come valutato da misure globali intensità di fluorescenza in un microscopio a fluorescenza normale (non mostrato), e l'altro è un non-transfettate controllo. Il record di tensione a 5A Figura (ottenuto dalla fibre muscolari che esprimono EYFP-ClC1) dimostra che a causa della conduttanza eccessivo di riposo, la fibra è quasi non-eccitabili. Impulsi di stimolo di corrente fino a 400nA (0,5 ms) necessario per essere utilizzato in modo da ottenere una risposta molto piccolo attivo (no, 5A Figura overshoot). Dopo la sostituzione della soluzione Tyrode esterno su uno contenente 500 mM del bloccante dei canali del cloruro 9-ACA, 200 impulsi nA di corrente sono stati sufficienti a provocare un potenziale d'azione (Figura 5B), anche se molto più lento e più ampio rispetto a quelli registrati in fibra di controllo ( Figura 5C). Come previsto, l'aggiunta di 9-ACA aveva effetti minimi su questa fibra di controllo (Figura 5D).

Figura 1. Efficienza Transfection delle in-vivo metodo di elettroporazione. Brightfield (A) e di fluorescenza (B) le immagini di un muscolo FDB transfettate con PMR-mCherry. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 12 giorni. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 1.

Figura 2. Espressione e targeting di α-actinina-EGFP in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EGFP e immagini SHG, rispettivamente, di una fibra che esprimono α-actinina-EGFP. Panel C è una sovrapposizione delle immagini in A e B. I pannelli D ed E sono immagini di fluorescenza di un'altra fibra che esprimono α-actinina-EGFP e colorati con di-8-ANEPPS, rispettivamente. Pannello F è la sovrapposizione di immagini in D ed E. giorni dopo l'elettroporazione protocollo: 6 giorni.

Figura 3. Espressione e targeting di EGFP-DHPRα1s in fibre FDB. Un pannello, immagine EGFP fluorescenza di un gruppo di fibre che esprimono EGFP-DHPRα1s. Pannello B è un ampliamento della piazza in un pannello per mostrare meglio il modello a bande di espressione della proteina. Panel C è l'immagine SHG corrispondente all'immagine in pannello A. Pannello di D è la sovrapposizione delle immagini A e C. Pannello di E è un allargamento della zona indicata nel pannello di D. Giorni dopo il protocollo di elettroporazione: 20 giorni.

Figura 4. Espressione e targeting di EYFP-ClC1 in fibre FDB. Pannelli A e B sono fluorescenza EYFP e immagini SHG, rispettivamente, di fibre che esprimono EYFP-ClC1. Pannello C è la sovrapposizione delle immagini in pannelli A e B. Pannello di D è un profilo di intensità misurata lungo la linea bianca evidenziata nell'immagine in pannello Giorni C. dopo il protocollo di elettroporazione: 7 giorni.

Figura 5. Fibre valutazione elettrofisiologici esprimere transgenici EYFP-ClC1. Pannelli A e B sono record tensione da una fibra che esprime EYFP-ClC1 in risposta ad impulsi di corrente, prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente. Pannelli C e D sono i record di tensione (potenziali di azione) ha provocato in risposta ad impulsi di corrente in modo non transfettate fibra prima e dopo il trattamento con 9-ACA, rispettivamente.

Descriviamo qui la procedura dettagliata da seguire per raggiungere trasfezioni efficace di plasmidi DNA in fibre muscolari scheletriche di elettroporazione in vivo. I principali vantaggi del nostro approccio sono la semplicità di implementazione, e la sua minima invasività che si traduce in rischio per la salute trascurabile per gli animali. In realtà, i protocolli sopra descritti elettroporazione non implicano molto di più di due iniezioni sottocutanee per piede, seguito da un protocollo di stimolazione elettrica, che sono tutti ben tollerati dagli animali sotto anestesia. Nel nostro istituto queste manipolazioni sono del tutto decisi a non essere le procedure chirurgiche in quanto non comportano l'apertura della pelle. Inoltre, la mitezza delle procedure di elettroporazione è un fattore critico per il successo complessivo nel raggiungimento di una trasfezione efficiente plasmide e l'espressione della proteina successiva da parte delle fibre muscolari in quanto ogni danno cellulare significativi possano pregiudicare la loro capacità di impegnarsi in modo efficiente nella sintesi delle proteine ​​attive.

Piccole modifiche alle procedure descritte qui può essere (e sono state) implementato per i più grandi muscoli del piede del mouse (per esempio estensore lungo delle dita, EDL, tibiale anteriore, TA, e, soleo). Inoltre, solo scaling up la quantità totale di DNA, abbiamo implementato procedure specifiche qui descritte al fine di trasfezione i muscoli FDB e IO di ratti adulti con grande successo.

Anche se i protocolli di trasfezione sempre come risultato un livello variabile di espressione di proteine ​​transgeniche da fibre muscolari, questo può essere sfruttato in esperimenti di fisiologia, non esprime le fibre possono essere utilizzati come controlli, e fibre con differenti livelli di espressione può essere utilizzata per correlare il livello di espressione con il livello di cambiamento di funzione. Inoltre, i promotori CMV sono stati trovati per essere giusti a cedere alti livelli di espressione della proteina, altri promotori muscolo-specifici può migliorare l'efficacia di espressione della proteina. Va notato che quando non è possibile (o conveniente) per esprimere costruisce proteina fluorescente-tag nelle fibre muscolari, siamo riusciti ad esprimere proteine ​​senza tag e monitorare il livello di espressione con i plasmidi bicistronic che contemporaneamente codificare una proteina fluorescente.