Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Parte 1: Configurando

1. Preparação de meio de cultura celular

Antes de iniciar a preparação de médio recolher todos os materiais e ferramentas que você precisa.
Descongelar 2 x 56 ml alíquotas de pool de lisado de plaquetas humanas (pHPL, self-made: referência 1 & JOVE # 1523), 10 ml de uma penicilina 100x / solução estreptomicina, 2 x 5 mL de L-Glutamina (ambos Sigma).

Descongele a citocina e, as alíquotas do fator de crescimento (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrocortisona, ácido ascórbico, Heparina, Anfotericina fornecido como 'quots single') ajustados para completar 1 garrafa (500 ml) de EGM-2 médios (Lonza).

Da geladeira tomar uma garrafa de 500 ml cada um dos (i) alfa-modificado meio essencial mínimo (a-MEM) e (ii) médio endotelial basal (EBM).

Todos os passos seguintes são executadas em um fluxo laminar de cultura de tecidos em condições estéreis.

Prepare heparina sem conservantes (por exemplo, Biochrom) pela dissolução do pó para uma concentração final de 1000 UI / ml com água estéril.

MSC Médio:

Use 500 mL de uma MEM, adicione 56 ml de pHPL descongelados (ver também referência 1 para mais detalhes) e 2 UI / mL (= 224 ml de solução-estoque) de heparina sem conservantes (evita a coagulação do meio através do acúmulo de o fibrinogênio no plasma) para alcançar uma concentração final de pHPL 10%. Além disso adicionar penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100μg/mL) e solução de 2mM de L-glutamina (ambos Sigma).

Filtrar o meio através do filtro a vácuo a 20 mM de poros tamanho (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).

ECFC-Medium:

Use uma garrafa (500 ml) de EBM, adicionar as alíquotas de citocinas, 56 mL de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl da solução de reserva) de conservante livre de Heparina, Penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100 g / mL de solução) e 2mM de L-glutamina ao meio basal e com um filtro de 20 l de poros tamanho vácuo filtro (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo).

2. Esterilização de instrumentos cirúrgicos

Fórceps, tesoura afiada cirúrgica e deve ser titular bisturi calor descartáveis ​​esterilizados minério estéril.

3. Preparação de tubos para coleta de medula

Adicionar 500 UI de conservante - heparina livre para 50 tubos de polipropileno ml (Falcon) e ajustar a um volume final de 20 mL com PBS. Transferir os tubos para a sala de parto.

4. Consentimento informado (confirmado por seu comitê de ética local ou IRB).

Pergunte aos pais antes da entrega, se quiser doar um pedaço do cabo e informá-los adequadamente dos propósitos que irá servir.

5. Doação de medula

Após a entrega e fiscalização da placenta e do cordão cortou um pedaço de 10 cm e imediatamente transferir para o tubo pré-carregada com heparina para evitar coagulação do sangue remanescente no interior dos vasos do cordão umbilical. Continuar com o isolamento de células mais rapidamente possível.

Parte 2: Célula de isolamento

1. Prepare câmara de fluxo laminar de cultura de tecido de limpeza de superfícies com Incidin ou 70% EtOH. Lugar estéril 150 centímetros ² placas de cultura de células, 75 cm frascos de cultura de células (ambos Corning), PBS, instrumentos cirúrgicos esterilizados, raspadores celular, suporte para tubos, 25 stripettes mL e 5 seringas ml equipados com agulhas final blunt adequadamente em sua capa limpa.
2. Pré-aquecer o seu preparada α-MEM e EGM-2 meio de cultura celular para 37 ° C em banho-maria.
3. Trazer o cabo da sala de parto para o seu laboratório equipado com o capô de cultura de células. Depois de transferir o cabo no fluxo laminar lavá-la duas vezes em PBS (por transferência para um novo prato) para se livrar de contaminar células do sangue. Lavar a veia umbilical após canulating-lo de um lado com uma seringa de 5 mL estéril equipada com uma agulha sem corte final com PBS até que o líquido que sai do outro lado do cabo torna-se completamente transparente (avermelhada indica a contaminação do sangue).

ECFCs:

4. Prepare a 75 cm ² frasco (Corning), rotulá-la e preencher 15-20 mL de pré-aquecido médio EGM-2.
5. Coloque o cabo em um novo prato cheio de PBS estéril.
   
   Pegue a tesoura cirúrgica e cortar o cordão umbilical em dois pedaços de cerca de 5 cm de comprimento (peças curtas são mais fáceis de processo, porque os vasos umbilicais são torcidas ao longo de seu eixo).
6. Tentar encontrar a veia umbilical (vaso grande), coloque uma lâmina de sua tesoura cirúrgica e cortar a veia longitudinalmente. Neste ponto ele poderia ser útil se um assistente pode manter a veia já cortados com duas pinças quando você cortar ainda mais.
7. Coloque a torta de medulace com a veia cortada em um novo prato, sem PBS, tomar o raspador de células e raspe a superfície (endoteliais) interior da veia umbilical por decalques de um lado para o outro. Transferência das células para o seu frasco de preparado por limpar a ponta do raspador no meio. Repita este procedimento pelo menos 10 vezes.
8. Fechar o frasco e colocá-lo em uma incubadora (37 ° C, 5% CO _2, 95% de umidade).

CTMs:

4. Prepare uma placa de cultura 150 centímetros ² (Corning) e rotulá-la.
5. Pegue o pedaço de corda (depois de raspar a camada endotelial) e cortar o cordão inteiro em pedaços muito pequenos, usando uma tesoura esterilizada e bisturi estéril. Tamanho máximo das peças cabo deve ser de 1-2 mm.
6. Transferência de peças do seu cordão umbilical com a pinça estéril em sua placa de cultura pré-rotulados. Ao deixar a placa aberta por 5 minutos antes de encher com o meio, o anexo das peças para a superfície de plástico é fortalecida.
7. Uma vez que as peças cabo está conectado adequadamente ao plástico, gentilmente adicionar em 30-35 mL de pré-aquecido alfa modificado MEM. Tente usar a velocidade mais baixa para ter certeza de que todas as peças permanecem em anexo.
8. Feche a placa e colocá-lo em uma incubadora (37 ° C, 5% CO _2, 95% de umidade).

Parte 3: expansão da célula e confirmação do fenótipo-imune por citometria de fluxo

Expansão de células

EFCFs:

1. Verificar a fixação das células endoteliais no dia seguinte em um microscópio invertido e troca de toda EGM-2 médio para se livrar de todas as células não-inscritos e partículas.
2. Expandir as células, até confluência e de intercâmbio de um terço da média duas vezes por semana. Quando confluência é atingido, retire as células com 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e transferi-los aos navios nova cultura. Dependendo do número de células dentro do seu frasco T75, você deve escolher o tamanho eo número de seu novo frascos para garantir a densidade de semeadura baixo para uma maior expansão.
3. Troca de um terço da média duas vezes por semana durante a expansão das células.

CTMs:

1. A conseqüência de CTMs da medula vai levar mais tempo, então você pode esperar pelo menos 3-4 dias até que você verificar em um microscópio invertido para o aparecimento de células fusiformes nos arredores das peças de tecido em anexo. Quando há células suficientes para o crescimento, as peças tendem a destacar porque eles perdem contato com o plástico.
2. Depois de 10-12 dias retire os pedaços de tecido, retire as CTMs do plástico com 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e transferi-los aos navios nova cultura. Dependendo da quantidade de células dentro de seu prato, você deve decidir o tamanho eo número de seu novo frascos para garantir a densidade de semeadura baixo para uma maior expansão.
3. Troca de um terço da média duas vezes por semana durante a expansão das células.

Citometria de fluxo

Equipamento necessário:

Citômetro de fluxo (BD FACSCalibur), micronic tubos (Corning), suporte do tubo, ovelhas soro (bloqueio de reagentes), Eppifuge (Eppendorf), os anticorpos monoclonais
MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, controles isotipo
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, controles isotipo

1. Depois de atingir confluência, retire a célula com 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA e centrifugar a 300 g por 7 min a 4 ° C.
2. Ressuspender as células a uma concentração de 1x10 ⁶ células / mL em PBS modificado e ligação do anticorpo inespecífico bloco com 10% v / v ovelhas soro por 20 min a 4 ° C.
3. Identifique os tubos micronic e adicione a concentração adequada de anticorpos fluorescentes marcados.
4. Adicionar 50 ul da suspensão celular (bloqueado) a cada tubo e incubar por 30 min a 4 ° C.
5. Lave as células modificadas pela adição de PBS para remover os anticorpos não vinculativa.
6. Ir com o seu celular rotulados para o citômetro de fluxo e realizar a análise.

Parte 4: ECFC colônia de crescimento, a fixação coloração e análise de hierarquia

1. A semente ECFCs praticamente pura colhida em densidade muito baixa chapeamento de 3 ou 10 células por centímetro quadrado em placas de cultura de células para permitir o crescimento única colônia.
2. Troca de um terço da média duas vezes por semana.
3. Depois de 14 dias (fim da cultura) remova o meio, lave duas vezes com PBS e corrigir as colônias com gelo solução de fixação a frio (acetona: metanol = 3, 2) por 15 minutos na geladeira.
4. Descartar a solução de fixação e deixar as placas aberto para secar por 10 minutos.
5. Hidratar as células com água destilada por 10 minutos.
6. Adicionar solução de hematoxilina de Harris e mancha as colônias fixadas por 12 minutos.
7. Remover H solução matoxylin e enxaguar as placas com água da torneira para se livrar da solução corante remanescente.
8. Tirar fotos de cada colônia porusando um estereomicroscópio e importação *. jpg ou *. tif formato em seu computador.
9. Abra as fotos com software ImageJ e analisar o número de células exata de cada colônia, conforme descrito na animação.
10. Abra o software ImageJ e importar uma imagem colônia usando o 'File \ Open "função no menu suspenso.
11. Continuar usando o "Processo de \ Background Subtrair" função
12. Use a função 'seleção elíptica * * escova ou' no menu ImageJ para marcar a margem colônia.
13. Limpar a imagem ao redor usando o "Editar \ Fora Clear 'função e cortar a imagem, selecionando' Imagem Cortar \ '.
14. Ajustar o limite manualmente usando o "Imagem \ Ajuste \ Threshold" função, para que todas as células estão completamente coloridos em vermelho.
15. Conte o número de células da colônia, selecionando "Analisar \ Analise Partículas '. Escolha as configurações apropriadas (otimizadas para cada tipo de célula) e selecione 'OK'. A caixa de resultados, incluindo contagem de células e uma nova imagem contendo os contornos correspondentes das células contadas aparecerá.
    

Há uma variedade de fontes de onde começar ou MSCs ECFCs incluindo a medula óssea, tecido adiposo, sangue do cordão umbilical, etc

É necessário ter ambos os tipos de progenitores da mesma fonte para comparar diretamente o envolvimento dos diferentes tipos de células em processos como tecidos e regeneração de navio ou de contribuição para a progressão do tumor.

A facilidade com que a isolar e, posteriormente, estudar pares autólogo de ECFCs e MSCs do mesmo doador faz este método vantajoso para exclusão de doadores variações dentro experiências individuais.

Possível contaminação com células hematopoiéticas é minimizado através de um passo passaging e confirmado com citometria de fluxo.

Se feito corretamente, as células isoladas devem (i) apresenta partes de células progenitoras, (ii) estar disponível para transplante experimental em quantidades suficientes e (iii) ser puro como foi confirmado por citometria de fluxo.