تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J. Vis. Exp. (33), e1543, doi:10.3791/1543 (2009).

تشريح الحصين التلفيف المسنن

1. ماوس في تخدير عميق ، تشريح الدماغ بدقة من خارج الجمجمة ووضعه في الفوسفات مخزنة المالحة الجليد الباردة (PBS).
2. في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة PBS ، وقطع الدماغ على طول الشق الطولي للمخ باستخدام سكين الجراحية ، وقطع المناطق الخلفية لامدا (الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر ، والمخيخ).
3. مكان نصف الكرة المخية الجانب الإنسي صعودا و، وذلك باستخدام ملقط ، وإزالة بعناية الدماغ البيني (المهاد وتحت المهاد) تحت مجهر تشريح. وسوف يعرض هذا الجانب الإنسي من الحصين ، والسماح للتصور من التلفيف المسنن. التلفيف المسنن تكون مميزة من قرن آمون بواسطة الفجوات بينهما. سوف إصابة الحصين أو المنطقة المحيطة بها جعل الأمر أكثر صعوبة لعزل التلفيف المسنن.
4. إدراج حادة إبرة طرف (على سبيل المثال ، 27 قياس إبرة) في كل جانب من التلفيف المسنن (حدود التلفيف المسنن والهورن آمون ؛ الشكل 1) ، وحرك الإبر سطحيا على طول محور الحاجز والزمانية الحصين لعزل التلفيف المسنن.
5. التقط التلفيف المسنن معزولة باستخدام إبرة أو ملقط ووضعها في أنبوب العينة. ويمكن بالتالي استخدام الأنسجة التي تم الحصول عليها التلفيف المسنن العينة على الفور الحصول على أي فحص أو تخزينه في الفريزر العميقة لاستخدامها لاحقا.
6. عزل التلفيف المسنن من نصف الكرة المخية الأخرى التي تستخدم نفس الأسلوب.

الكمية في الوقت الحقيقي PCR

تم عزل التلفيف المسنن باستخدام الأسلوب المذكورة أعلاه ، وكان تشريح الحصين المتبقية على النحو عينة قرن آمون في البرية من نوع من الفئران. وأجريت في الوقت الحقيقي PCR بيتا من أكتين ، TDO2 ، DSP ، وMrg1b Tyro3 مع التلفيف المسنن وعينات الهورن آمون كما هو موضح سابقا ^1. واستخدمت أجهزة الاشعال 5' - CTGGCGAGATCACGATGACG و5' AAGCTACGCTGTTGTCTAACC مقابل Mrg1b وGCCTCCAAATTGCCCGTCA و5' CCAGCACTGGTACATGAGATCA مقابل Tyro3.

تحليل ميكروأري

وقد أجريت تجارب على الفئران البرية ميكروأري من نوع الفئران الذكور ومتخالف للشكل الإسوي ألفا من الكالسيوم / كالمودولين بروتين كيناز التي تعتمد على الثاني (ألفا كناس CaMKII + / -- الفئران) كما هو موضح سابقا ^1. باختصار ، كان تهجين الحمض النووي الريبي معزولة عن الحصين كليا أو التلفيف المسنن من الفئران البرية من نوع ومتحولة مع مجموعة جينوم الفأر 2.0 430 (Affymetrix ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) ، وتفحص كل GeneChip من قبل الماسح GeneChip Affymetrix 3000 (GCS3000) . تم تنفيذ GeneChip التحليل مع تحليل ميكروأري جناح الإصدار 5.0.

التلفيف المسنن تحتل ما يقرب من 25 ٪ إلى 30 ٪ من حجم ^2،3 تشكيل الحصين. انها تركيبة فريدة الخلية وتلعب أدوارا حاسمة في وظائف الدماغ المختلفة. ولذلك ، وتقنيات لعزل التلفيف المسنن مفيدة لتحليل الأحداث التي تحدث على وجه التحديد في هذه المنطقة.

هنا ، وأثبتنا لإجراء تشريح بكفاءة التلفيف المسنن من الحصين الماوس الكبار وأكد دقة هذه التقنية. الأول ، كشفت دراسة نسيجية أن تم فصل التلفيف المسنن دون التلوث مناطق أخرى (الشكل 1) ، تشير إلى أنه يمكن إعداد عينة نقية التلفيف المسنن.

الثانية ، وأكد لنا ان يتم تشريح الأنسجة التلفيف المسنن عن طريق إجراء PCR الوقت الحقيقي للجينات التلفيف المسنن محددة ، TDO2 وحزب اليسار الديمقراطى ، وقرن آمون الجينات المخصب ، وMrg1b Tyro3 ⁴ (الشكل 2). عبارات مرنا من TDO2 (ع = 0.000023 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) ، وحزب اليسار الديمقراطى (ع = 0.0000030 ، ن ل= 4 و 4 على التوالي) تم الكشف في العينات التلفيف المسنن عند مستويات أعلى من الواضح ، في حين Mrg1b (ع = 0.000080 ، ن = 4 وو 4 على التوالي) وTyro3 (ع = 0.00017 ؛ ن = 4 وو 4 على التوالي) كانت أقل المستويات ، من تلك الموجودة في عينات من قرن آمون. ولم مستويات التعبير بيتا أكتين لا تختلف في هذه العينات (ع = 0.11 ، ن = في 4 و 4 على التوالي). وبالتالي ، فإننا يمكن أن تحقق ما إذا كان أو لم تشريح دقيق التلفيف المسنن بها إجراء مثل بسيط في الوقت الحقيقي التجارب PCR.

قارنا الثالثة ، لتقييم مدى فائدة هذه الطريقة تشريح ، ومستوى التعبير مرنا الحصين مع ذلك كله من التلفيف المسنن. كله الحصين والتلفيف المسنن تم الحصول عليها من النوع البري (ن و= 9 و 4 على التوالي) ، وألفا كناس CaMKII + / -- تمت معالجة الفئران (= ن في 18 و 4 على التوالي) للتحليل [ميكروأري ، وبالنسبة لجميع الجينات وسجل ، وأمثالها تم احتساب التغيير عن طريق قسمة قيمة متحولة من قيمة من النوع البري. أشارت النتائج إلى أن تم الكشف عن التغييرات في التعبير مرنا ، وخصوصا من التلفيف المسنن جزيئات محددة مثل حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 ، مع ما يصل الى زيادة بنسبة 5 أضعاف في الحساسية في عينات التلفيف المسنن مقارنة عينات الحصين كامل (الجدول 1). أثبتنا سابقا أن ألفا كناس CaMKII + / -- معرض السلوكيات الفئران يتصل باضطرابات نفسية الإنسان ، مثل العجز في الذاكرة العاملة ، والإيقاع دون اليوماوي مبالغا فيه ^1،5. علاوة على ذلك ، ميزات المورفولوجي والكهربية للخلايا العصبية في التلفيف المسنن فئرانا معدلة وراثيا تشبه لافت للنظر لتلك الخلايا العصبية غير ناضجة التلفيف المسنن لدى القوارض العادية ، مشيرا إلى أن هذه الخلايا العصبية في الفئران الطافرة تفشل في تطوير إلى النضج ^1. وغير ناضجة التعبير التلفيف وهبوطا التنظيم ، المسنن من حزب اليسار الديمقراطى وTDO2 مرنا في ألفا كناس CaMKII + / -- الفئران تتفق مع الحقائق التي يمكن استخدامها DSP وTDO2 كعلامات من الخلايا الحبيبية ناضجة في التلفيف المسنن (أوهيرا وآخرون ، غير منشورة. البيانات).

أخذت معا ، ويمكن هذا الأسلوب تشريح مريحة ودقيقة تستخدم موثوق للدراسات ركزت على التلفيف المسنن. التلفيف المسنن الأنسجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تنطبق على أنواع أخرى من التحليلات أيضا ، بما في ذلك تحليلات بيولوجيا الخلية والبروتين.

الشكل 1. التحقق من التلفيف المسنن ومعزولة عن طريق دراسة نسيجية. تمت معالجة قسم من الدماغ الإكليلي بعد عزل التلفيف المسنن لتلطيخ نيسل (اللوحة اليمنى) ، والرسم التخطيطي مقتبس من مخ الفأر atlas6 يمثل تقريبا على نفس المستوى من المقطع هو موضح في اللوحة اليمنى (اللوحة اليمنى). تشير الأسهم لتوجيهات إبرة معلومات سرية. مقياس بار ، 1 ملم.

الشكل 2. التحقق من التلفيف المسنن لعزلها في الوقت الحقيقي PCR. تم تجهيز التلفيف المسنن والهورن عمون ليالي تم الحصول عليها من الفئران البرية من نوع أربعة لPCR الوقت الحقيقي من بيتا أكتين ، TDO2 ، DSP ، وMrg1b Tyro3. وتعرض نتائج كوسيلة ± SEM. على التحليل الإحصائي ، تم توظيف الطلاب ق ر الاختبار ، وتتبع القيم P : بيتا أكتين ، ع = 0.11 ؛ TDO2 ، ع = 0.000023 (** 1) ؛ DSP ، ع = 0.0000030 (** 2) ؛ Mrg1b ، ع = 0.000080 (** 3) ، وTyro3 ، ع = 0.00017 (** 4).

الجدول 1. . ميكروأري تحليل كامل الحصين والتلفيف المسنن الجينات وأعرب تفاضلي في التلفيف المسنن والحصين كامل ألفا كناس CaMKII + / -- تم تحديد الفئران عن طريق حساب التغيير أضعاف من تلك التي رصدت في البرية من نوع الفئران. وقد تم تحليل البيانات من أجل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار الطالب ر ق بين نوع البرية وألفا كناس CaMKII + / -- الفئران. بين الجينات التي عرضت التعبير ع <0.05 فيالتلفيف المسنن من + / ألفا كناس CaMKII -- الفئران مقارنة بما كان عليه من الفئران من النوع البري ، يتم سرد أهم 50 الجينات. علما أن عدد العينات لالتلفيف المسنن هي اقل بكثير من تلك التي لالحصين كله. AffyID ، Affymetrix التحقيق المعرف ؛ CKII ، ألفا كناس CaMKII + / -- الفئران ؛ WT والبرية من نوع الفئران.

وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للمعهد الوطني للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ، والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فوجيتا الصحة.

نشكر الدكتور يوكو Nabeshima في جامعة كيوتو للتعليم لها على تقنية التشريح والسيدة آكي Miyakawa فوجيتا الصحة في الجامعة للحصول على دعم لها الفيلم. وأيد هذا العمل عن طريق برنامج للترويج للدراسات الأساسية في العلوم الصحية التابع للمعهد الوطني للابتكار الطبية الحيوية ، على منحة في والمساعدات للأبحاث العلمية في المجالات ذات الأولوية ، التكاملية أبحاث الدماغ (شيان) -- من وزارة التربية في اليابان ، والتي منحة في والمعونة من قمة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا وكالة.

1. Yamasaki, N., Maekawa, M., Kobayashi, K., Kajii, Y., Maeda, J., Soma, M., Takao, K., Tanda, K., Ohira, K., Toyama, K., Kanzaki, K., Fukunaga, K., Sudo, Y., Ichinose, H., Ikeda, M., Iwata, N., Ozaki, N., Suzuki, H., Higuchi, M., Suhara, T., Yuasa, S. & Miyakawa, T. Alpha-CaMKII deficiency causes immature dentate gyrus, a novel candidate endophenotype of psychiatric disorders. Mol. Brain 1, 6 (2008).
2. Insausti, A. M., Megias, M., Crespo, D., Cruz-Orive, L. M., Dierssen, M., Vallina, I. F., Insausti, R. & Florez, J. Hippocampal volume and neuronal number in Ts65Dn mice: a murine model of Down syndrome. Neurosci. Lett. 253, 175 (1998).
3. Redwine, J. M., Kosofsky, B., Jacobs, R. E., Games, D., Reilly, J. F., Morrison, J. H., Young, W. G. & Bloom, F. E. Dentate gyrus volume is reduced before onset of plaque formation in PDAPP mice: a magnetic resonance microscopy and stereologic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 1381 (2003).
4. Lein, E. S., Zhao, X. & Gage, F. H. Defining a molecular atlas of the hippocampus using DNA microarrays and high-throughput in situ hybridization. J. Neurosci. 24, 3879 (2004).
5. Matsuo, N., Yamasaki, N., Ohira, K., Takao, K., Toyama, K., Eguchi, M., Yamaguchi, S. & Miyakawa, T. Neural activity changes underlying the working memory deficit in alpha-CaMKII heterozygous knockout mice. Front. Behav. Neurosci. 3, 20 (2009).
6. Franklin, K. B. J. & Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, Inc.: San Diego (1997).

12 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.