Aórtica Assay Anel

Um dia antes do experimento:

1. Permitir BME (fator de crescimento reduzido, Cultrex, Trevigen) para descongelar em gelo ou a 4 ° C, uma vez descongelado manter no gelo para evitar re-solidificação.

Dia do experimento:

1. Camundongos (6-7 semanas de idade) devem ser anestesiados e sangrado.
2. Remover da aorta torácica em uma placa de Petri cheia de frio estéril PBS.
3. Realizar limpeza mecânica do tecido circundante gordura. Note, evitar a secagem da Aorta a qualquer momento.
4. Usando uma lâmina cirúrgica, uma fatia de Aorta uniformemente em uma anéis mm. O corte deve ser uniforme e limpo.
5. Transferência de anéis para limpa e fria PBS e manter em gelo em todos os momentos.
6. Usando dicas pré-refrigeração pipeta, adicione a cada poço em um prato de 48 uma queda bem arredondado de 150 ml BME frio. Permitir a queda BME para solidificar a 37 ° C por 20-30 minutos.
7. Coloque um anel aórtico única no centro da parte superior de cada cúpula. Incubar por 10 minutos a 37 ° C.
8. No topo de cada anel adicionar um adicional de 150 ml BME. Incubar durante 20-30 minutos a 37 ° C.
9. Prepare médio: Human médio soro endotelial livre (GIBCO, Carlsbad, CA), suplementado com FCS a 2%, 50 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 50 mg / ml (Cellgro).
10. A cada poço adicionar 500 ml de meio contendo um ou outro:
    1. Amostras experimentais.
    2. Controlo positivo: suplemento de crescimento endotelial celular (ECGS, concentração final 200 mg / ml, BD Biosciences).
    3. Controle negativo: Médio sozinho.
11. Placa de incubar a 37 ° C por 12 dias, os anéis de fotografia entre os dias 6 e 12 sob estereoscópio padrão de contraste de fase.
12. Opcional: Colete sobrenadantes.

Notas:

1. Manter condições estéreis em todos os momentos.
2. Evitar a introdução de bolhas no BME.

Aórtica ensaio de anel é uma ferramenta benéfica sobre a maneira de avaliar angiogênico, bem como anti-angiogênico fatores. Os vasos que crescem para fora da aorta anéis recrutar células musculares lisas e pericitos para associar com o tubo de células endoteliais, o que significa que eles são anatomicamente semelhantes aos neovasos in vivo. Além disso, o mouse ensaio de anel aórtico tem a vantagem de a vasta gama de ferramentas de transgênicos disponíveis para esta espécie. No entanto, há várias desvantagens para o ensaio de anel aórtico. Primeiro, vasos conseqüência in vivo ocorre a partir de microvasos e não de grandes vasos como a aorta. Inconsistência, segundo o manuseio dos anéis e da quantidade de tecido circundante restante no navio pode influenciar conseqüência navio. Anéis de aorta ou idades diferentes ratos diferentes cepas e também pode interferir com as respostas angiogênico. E por último, conseqüência navio Angiogênicas ocorre em três dimensões, o que o torna não-ideal para fotografar e quantificar. Tomados em conjunto, quando realizada com suficiente controles internos e com múltiplas repetições, este ensaio é relativamente simples, não cara, altamente informativo e significativamente superior às culturas endoteliais em sua complexidade biológica e relevância.