प्राइमर एक्सटेंशन कैद: भारी अपमानित डीएनए स्रोत से लक्षित अनुक्रम रिट्रीवल

Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., et al. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

में रिपोर्ट अनुसंधान में इस विधि का इस्तेमाल किया गया था ब्रिग्स एट अल, 325 (5938) विज्ञान . 318-321 (2009) .

अभिकर्मकों की आवश्यकता:

• AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़
• 10x GeneAmp पीसीआर बफर द्वितीय
• MgCl ₂ 25mm
• dNTP मिश्रण, 25 मिमी प्रत्येक
• BSA, 10 मिलीग्राम पानी में ^{मिलीलीटर-1}
• आण्विक पानी जीव विज्ञान ग्रेड
• EB बफर (MinElute पीसीआर शोधन किट के साथ आपूर्ति), 10 मिमी Tris एचसीएल, 8.5 पीएच
• MinElute पीसीआर शोधन किट
• M-270 streptavidin Dynabeads
• 2x बाध्यकारी और धो बफर (BW) (2 एम NaCl, 10 Tris सीएल मिमी, 1 मिमी EDTA, पीएच 8.0, 0.2% 20 बीच)
• 1x बाध्यकारी और धो (BW) बफर (2x BindWash बफर पानी में पतला 2X)
• हॉट धो HW () बफर (2.5mm MgCl, 1X Taq गोल्ड बफर, 0.1% बीच 20)

निर्माता गैर मानक अभिकर्मकों और उपकरणों के बारे में जानकारी के लिए बाद में तालिका देखें.

1) लाइब्रेरी प्रवर्धन

1. डीएनए यहाँ टेम्पलेट एक 454 पुस्तकालय एक कम प्रतिलिपि संख्या डीएनए के रूप में वर्णित स्रोत (Rohland और Hofreiter, 2007a, 2007b) और (Maricic और Pääbo, 2009) से तैयार है. पूरे पुस्तकालय बढ़ाना करने के लिए, निम्न पीसीआर मिश्रण तैयार:

   अभिकर्मक	प्रतिक्रिया प्रति μl
   पानी	45
   10X जीन Amp पीसीआर बफर द्वितीय	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 मिलीग्राम / एमएल)	2
   dNTPs (25 मिमी प्रत्येक)	1
   454 emPCR अग्रेषित primer/10uM	3
   454 emPCR RVs primer/10uM	3
   AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू / μl)	1
   454 डीएनए पुस्तकालय टेम्पलेट	25
   कुल	100

2. एक थर्मो cycler में 14 चक्र के प्रवर्धन के लिए निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करें
   1. 95 ° 12min सी
   2. 95 ° सी 30
   3. 60 डिग्री सेल्सियस (या वांछित annealing अस्थायी) 1 मिनट
   4. 72 ° सी 1 मिनट
   5. 2 (13) x करने के लिए जाओ
   6. 72 ° 5min सी
   7. 10 डिग्री सेल्सियस ∞
3. Qiagen MinElute स्पिन निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्तंभ पर प्रतिक्रिया शुद्ध. 50 μl बफर EB में Elute.
4. यों शुद्ध प्रवर्धित उत्पाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से qPCR (मेयेर एट अल., 2007) के साथ unamplified लाइब्रेरी का एक विभाज्य. यदि प्रवर्धित उत्पाद अधिक से अधिक 1 एक्स 10 उल प्रति ¹² प्रतियां है, निम्न प्राइमर विस्तार चरण में टेम्पलेट की राशि को कम करने के लिए सुनिश्चित करें कि 10 एक्स नहीं 2 से ^अधिक 12 प्रतियां प्राइमर एक्सटेंशन प्रतिक्रिया के लिए जोड़ रहे हैं .

2) प्राइमर एक्सटेंशन

1. प्रतिक्रियाओं की अपेक्षित संख्या के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें.

   अभिकर्मक	प्रतिक्रिया प्रति μl
   पानी	45
   10X जीन Amp पीसीआर बफर द्वितीय	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 मिलीग्राम / एमएल)	2
   dNTPs (25 मिमी प्रत्येक)	1
   454 emPCR अग्रेषित primer/10uM	3
   454 emPCR RVs primer/10uM	3
   AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू / μl)	1
   454 डीएनए पुस्तकालय टेम्पलेट	25
   कुल	100

2. एकल प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया के लिए एक Thermocycler में निम्न प्रोग्राम चलाएँ :
   1. 95 ° 12min सी
   2. 60 डिग्री सेल्सियस (या अपने पीईसी प्राइमर अस्थायी annealing अलग अगर) 1 मिनट
   3. 72 ° सी 5 मिनट
   4. 72 ° सी हमेशा के लिए!
      
      महत्वपूर्ण कदम विस्तार के बाद 72 पर प्रतिक्रिया रखें ° सी. फिर सीधे विंदुक 150ul PBI या ट्यूबों में QIAGEN गर्मी ब्लॉक से हटाने से पहले MinElute शुद्धि के लिए पंजाब बफर. यह महत्वपूर्ण है के लिए गैर विशिष्ट प्राइमर से बचने annealing और कब्जा के रूप में मिश्रण ठंडा है.
3. एक Qiagen MinElute स्पिन स्तंभ पर प्रतिक्रिया निर्माता के निर्देशों के अनुसार, शुद्ध. 50 μl EB में Elute.

3) एक्सटेंशन उत्पाद कैद

1. M-270 मनकों की vortexing द्वारा Resuspend शेयर समाधान. नमूना प्रति 25 μl मनका निलंबन लो. मोती दो बार नमूना प्रति 25 μl 2xBW बफर में 500ul 2x BW बफर और resuspend के साथ धोएं.
2. 2.3 कदम से 3.1 कदम से 25 μl मनका निलंबन से 25 μl eluate जोड़ें. तो 1 के लिए बारी बारी से मिक्सकमरे के तापमान पर 5 मिनट.
   
   अनुशंसित: qPCR मात्रा का ठहराव के लिए 2.3 कदम से eluate के 5 उल शेष रहते हैं .
   
   
3. एक ताजा 1.5ml ट्यूब पूरे मिश्रण स्थानांतरण (इस करने के लिए गैर लक्ष्य पुस्तकालय टुकड़े के carryover को कम करने में मदद करता है). गोली चुंबकीय कण कलेक्टर (एमपीसी) का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
4. 500 μl 1xBW बफर (कई washes के लिए संभव के रूप में ज्यादा पृष्ठभूमि के रूप में दूर करने में मदद) के साथ 5 बार धोएं. पिछले धोने कदम के बाद, नीचे संक्षेप में स्पिन और पिछले निशान हटाने की सतह पर तैरनेवाला.
5. 500μl 1x गरम धो बफर (HW) जोड़ें. 65 में 2 मिनट के लिए हिलाओ डिग्री सेल्सियस (या 5C पीईसी प्राइमर Tm ऊपर) एक थर्मल ब्लॉक पर है. सतह पर तैरनेवाला जल्दी से इस के बाद, को हटाने के लिए नीचे ठंडा कम से कम. (यह कदम पृष्ठभूमि अभी भी पीईसी प्राइमरों, लेकिन वास्तव में विस्तार चरण के दौरान विस्तारित पर नहीं के साथ जुड़े टुकड़े दूर है). पिछले निशान हटाने की सतह पर तैरनेवाला.
6. 30 μl EB बफर में मनका गोली Resuspend. एक ताजा 1.5ml ट्यूब पूरे मिश्रण स्थानांतरण (इस करने के लिए गैर लक्ष्य पुस्तकालय टुकड़े के carryover को कम करने में मदद करता है). Elution के लिए एक थर्मल cycler में 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. MPC में रखें और सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, ध्यान लेने के मनकों को पीछे छोड़.

4) कैप्चर उत्पाद प्रवर्धन

1. नमूनों की अपेक्षित संख्या के लिए एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें.

   अभिकर्मक	प्रतिक्रिया प्रति μl
   पानी	45
   10X जीन Amp पीसीआर बफर द्वितीय	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 मिलीग्राम / एमएल)	2
   dNTPs (25 मिमी प्रत्येक)	1
   454 emPCR अग्रेषित primer/10uM	3
   454 emPCR RVs primer/10uM	3
   AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू / μl)	1
   Eluted कब्जा उत्पाद	25
   कुल	100

2. 14 चक्रों के प्रवर्धन के लिए एक थर्मो cycler में निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करें :
   1. 95 ° 12min सी
   2. 95 ° सी 30
   3. 60 डिग्री सेल्सियस (या वांछित annealing अस्थायी) 1 मिनट
   4. 72 ° सी 1 मिनट
   5. 2 (13) x करने के लिए जाओ
   6. 72 ° 5min सी
   7. 10 डिग्री सेल्सियस ∞
3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Qiagen MinElute सिलिका स्पिन स्तंभ पर प्रतिक्रिया शुद्ध. 50 μl EB बफर में Elute. उत्पाद अब कब्जा के एक दूसरे दौर के लिए किया जा सकता है या तो इस्तेमाल किया, 2.1 कदम पर शुरू, या 454 अनुक्रमण के लिए पायस पीसीआर प्रोटोकॉल, में सीधे प्रवेश किया.

प्रतिनिधि परिणाम:

में सिफारिश सामान्य के साथ मिलाया जाता है - यह जोरदार सिफारिश की है जब पीईसी प्रोटोकॉल के साथ बाहर शुरू करने के लिए पहले एक पर कब्जा प्रतिक्रिया जहां एक 'सकारात्मक नियंत्रण के लक्ष्य अनुक्रम' (1 picogram आसानी से पर्याप्त है जैसे एक ~ 100bp पीसीआर उत्पाद) की एक छोटी राशि प्रदर्शन की राशि 454 पुस्तकालय टेम्पलेट प्रवर्धित (2.1 कदम देखें), और कब्जा एक एकल पीईसी के लिए सकारात्मक नियंत्रण उत्पाद पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन प्राइमर के साथ किया जाता है. यदि इस पर नियंत्रण प्रतिक्रिया नियंत्रण विशिष्ट दोनों सकारात्मक और 454 एडाप्टर विशिष्ट प्राइमर जोड़े के साथ किया जाता है qPCR प्राइमर एक्सटेंशन (1.3) शुद्ध प्रतिक्रिया प्राइमर विस्तार उत्पाद (2.3 में पृष्ठभूमि बनाम नियंत्रण के लक्ष्य की राशि मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ) और eluted मनका कब्जा उत्पाद (3.6). इस तरह, पृष्ठभूमि ("विशिष्टता") और अपने प्रयोगात्मक परिस्थितियों में लक्ष्य वसूली ("संवेदनशीलता") की क्षमता हटाने के दोनों प्रभाव सीधे मापा जा सकता है है.

एक सफल पीईसी प्रोटोकॉल आम तौर पर निम्नलिखित गुण है -

संवेदनशीलता (प्रोटोकॉल के माध्यम से बनाए रखा नियंत्रण के लक्ष्य की राशि से मापा) :
Eluted मनका कब्जा उत्पाद में नियंत्रण लक्ष्य की कुल राशि (3.6) = ~ शुद्ध प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया (2.3) में कुल राशि के 1-20%.

पृष्ठभूमि (454 emPCR प्राइमर जोड़ी द्वारा मापा):
Eluted मनका कब्जा उत्पाद (3.6) में पृष्ठभूमि की कुल राशि <शुद्ध प्राइमर विस्तार रिएक्शन (2.3) में कुल राशि का 0.01% है .

यदि अंतिम उत्पाद में शेष लक्ष्य का कम से कम 1% है, किताब विस्तार कदम असफल रहा हो सकता है और जांच की जानी चाहिए.

अगर वहाँ अंतिम उत्पाद में शेष पृष्ठभूमि के 0.01% से ज्यादा है, धोने कदम गलत किया गया है प्रदर्शन कर सकते हैं और जांच की जानी चाहिए.

पीईसी विधि सरल, जल्दी, संवेदनशील और विशिष्ट है. इसलिए हम लेखकों की परिकल्पना की गई है प्राचीन डीएनए के बाहर कई छोटे आरएनए टुकड़े के एक शाही सेना पुस्तकालय से कब्जा जमा नमूना या (या अन्य loci) एक metagenomic नमूना से -16 विविधता का कब्जा में संरचनात्मक परिवर्तन से पूछताछ के रूप में, आवेदन. एक बिंदु पर उल्लेख है कि कब्जा की संवेदनशीलता एक मल्टीप्लेक्स पर कब्जा प्रतिक्रिया में बढ़ पीईसी प्राइमरों की संख्या के रूप में कम हो जाता है. पीईसी इसलिए बहुत बड़ी है (उदाहरण के लिए एक या अधिक megabase) पर कब्जा क्षेत्रों के कब्जा करने के लिए आदर्श अनुकूल नहीं है, लेकिन बहुत अच्छी तरह से छोटे से लक्ष्य या क्षेत्रों के एक तेजी से फैशन में कई व्यक्तियों से भी SNP पदों के पर कब्जा करने के लिए अनुकूल है.

विज्ञान और कला के क्रोएशियाई अकादमी और बर्लिन-Brandenburg रसद और वैज्ञानिक समर्थन के लिए विज्ञान अकादमी, और वित्तीय समर्थन के लिए मैक्स प्लैंक सोसायटी के राष्ट्रपति अभिनव कोष हम सलाह के लिए एम. मेयेर धन्यवाद. JMG एक NSF अंतरराष्ट्रीय postdoctoral फैलोशिप (Oise 0,754,461) द्वारा समर्थित किया गया. 1 Neandertal (1 Feldhofer) FM865407, Neandertal 2 (2 Feldhofer) FM865408, Sidron FM865409 1253, Vindija FM865410 33.25, 1 Mezmaiskaya FM865411: दृश्यों परिग्रहण संख्या के साथ EBI nucleotide डेटाबेस में जमा कर रहे हैं

1. Briggs AW, Good JM, Green RE, Krause J, Maricic T, Stenzel U, Lalueza-Fox C, Rudan P, Brajkovic D, Kucan Z, Gusic I, Schmitz R, Doronichev VB, Golovanova LV, de la Rasilla M, Fortea J, Rosas A, Paabo S. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science 325(5938): 318-321 (2009).
2. Rohland N, Hofreiter M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques 42(3): 343-352 (2007).
3. Rohland N, Hofreiter M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc 2(7) : 1756-1762 (2007).
4. Maricic T, Pääbo S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands Biotechniques 46(1): 51-57 (2009).
5. Meyer M, Briggs AW, Maricic T, Hober B, Hoffner B, Krause J, Weihmann A, Paabo S, Hofreiter M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res 36 (1) e5 (2007).

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