Primer Capture Estensione: Recupero sequenza mirata da fonti DNA fortemente degradate

Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., et al. Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources. J. Vis. Exp. (31), e1573, doi:10.3791/1573 (2009).

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Briggs et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009) .

Reagenti richiesti:

• AmpliTaq Gold DNA polimerasi
• 10x GeneAmp PCR Buffer II
• _MgCl2 25mM
• dNTP mix, 25 mm ciascuno
• BSA, 10 mg ^ml-1 in acqua
• Biologia molecolare acqua di grado
• EB tampone (fornito con il kit MinElute purificazione PCR), 10 mM Tris HCl, pH 8,5
• MinElute PCR Purification Kit
• M-270 streptavidina Dynabeads
• 2x Binding e Wash (BW) buffer (2 M di NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20)
• 1x Binding e Wash (BW) buffer (2x tampone 2X BindWash diluito in acqua)
• Hot Wash (HW) buffer (2,5 mm MgCl, 1X Taq Oro tampone, 0,1% Tween 20)

Per informazioni sul produttore in materia di non-standard reagenti e attrezzature vediamo dopo tavola.

1) Biblioteca di amplificazione

1. Il modello di DNA qui è una libreria di 454 preparata da una fonte a basso numero di copie del DNA, come descritto in (Rohland e Hofreiter, 2007a, 2007b) e (Maricic e Pääbo, 2009). Per amplificare l'intera biblioteca, preparare l'impasto seguenti PCR:

   Reagente	microlitri per reazione
   Acqua	45
   10X Gene Amp PCR tampone II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mm ciascuno)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL)	1
   454 DNA stampo biblioteca	25
   Totale	100

2. Utilizza il seguente programma PCR in un Thermo cycler per 14 cicli di amplificazione
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C '30
   3. 60 ° C (temperatura di ricottura o desiderato) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Vai a 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purificare la reazione sopra una colonna Qiagen giro MinElute secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri di buffer EB.
4. Quantificare il prodotto purificato amplificato e un aliquota della biblioteca non amplificata con qPCR (Meyer et al., 2007). Se il prodotto amplificato ha più di 1 X 10 ¹² copie per ul, ridurre la quantità di modello nella fase successiva estensione Primer per garantire che non più di 2 x 10 ¹² copie vengono aggiunti alla reazione di primer extension.

2) Primer Extension

1. Preparare una master mix per il numero di reazioni.

   Reagente	microlitri per reazione
   Acqua	45
   10X Gene Amp PCR tampone II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mm ciascuno)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL)	1
   454 DNA stampo biblioteca	25
   Totale	100

2. Eseguire il seguente programma in un termociclatore per la reazione singolo primer extension:
   1. 95 ° C 12min
   2. 60 ° C (o il vostro PEC fondo ricottura temperatura se diverso) 1 min
   3. 72 ° C 5 min
   4. 72 ° C per sempre!
      
      PUNTO CRITICO Mantenere reazione dopo l'estensione a 72 ° C. Poi direttamente pipetta 150ul PBI o PB tampone per la depurazione QIAGEN MinElute nei tubi prima di togliere dal blocco di calore. Questo è importante per evitare di non-specifico fondo di ricottura e catturare il composto si raffredda.
3. Purificare la reazione sopra una colonna Qiagen giro MinElute, secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri EB.

3) estensione Capture prodotto

1. Risospendere soluzione madre di M-270 perle vortexando. Estrarre 25 microlitri sospensione tallone per campione. Lavare due volte con le perline 500ul 2x BW buffer e risospendere in 25 microlitri di buffer 2xBW per campione.
2. Aggiungere 25 microlitri eluato dal passo 2,3-25 microlitri sospensione perle dal punto 3.1. Mescolare poi ruotare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   
   Raccomandati: tenere restante 5 ul dell'eluato dal punto 2.3 per la quantificazione qPCR.
   
   
3. Trasferire il composto tutto in una nuova provetta 1,5 ml (questo aiuta a ridurre il riporto di non bersaglio frammenti biblioteca). Pellet il surnatante con il collettore di particelle magnetiche (MPC) e scartare il surnatante.
4. Lavare 5 volte con 500 microlitri di buffer 1xBW (molti lavaggi aiutano a rimuovere come sfondo il più possibile). Dopo la fase di lavaggio scorso, centrifugare brevemente e rimuovere le ultime tracce di sopranatante.
5. Aggiungere 500μl 1x Hot Wash (HW) buffer. Agitare per 2 minuti a 65 ° C (o 5C sopra il primer PEC Tm) su un blocco termico. Rimuovere il surnatante subito dopo questo, per ridurre al minimo il raffreddamento. (Questo passaggio è quello di rimuovere i frammenti di fondo ancora associato con primer PEC, ma non di fatto esteso durante la fase di estensione). Rimuovere le ultime tracce di sopranatante.
6. Risospendere il pellet tallone in 30 microlitri di buffer EB. Trasferire il composto tutto in una nuova provetta 1,5 ml (questo aiuta a ridurre il riporto di non bersaglio frammenti biblioteca). Incubare a 95 ° C per 3 minuti in un termociclatore per l'eluizione. Posto nella MPC e rimuovere il supernatante, avendo cura di lasciare alle spalle le perline.

4) Acquisizione di amplificazione del prodotto

1. Preparare una master mix PCR per il numero di campioni.

   Reagente	microlitri per reazione
   Acqua	45
   10X Gene Amp PCR tampone II	10
   MgCl 2 (25mm)	10
   BSA (10 mg / ml)	2
   dNTPs (25 mm ciascuno)	1
   454 emPCR fwd primer/10uM	3
   454 emPCR RVS primer/10uM	3
   AmpliTaq Gold DNA polimerasi (5 U / mL)	1
   L'acquisizione dei prodotti eluiti	25
   Totale	100

2. Utilizza il seguente programma PCR in un Thermo cycler per 14 cicli di amplificazione:
   1. 95 ° C 12min
   2. 95 ° C '30
   3. 60 ° C (temperatura di ricottura o desiderato) 1 min
   4. 72 ° C 1 min
   5. Vai a 2 (x 13)
   6. 72 ° C 5min
   7. 10 ° C ∞
3. Purificare la reazione sopra una colonna di silice giro Qiagen MinElute secondo le istruzioni del produttore. Eluire in 50 microlitri di buffer EB. Il prodotto può essere ora utilizzato sia per un secondo round di cattura, a partire dal punto 2.1, o inserito direttamente in emulsione 454 Protocollo PCR, per il sequenziamento.

Rappresentante dei risultati:

E 'fortemente consigliato quando si inizia con il protocollo PEC per effettuare prima una reazione di cattura in cui una piccola quantità di una' sequenza positiva obiettivo di controllo '(ad esempio un ~ 100bp prodotto di PCR - 1 picogrammo è abbastanza facilmente) si mescola con il normale raccomandata quantità di amplificato 454 Template Library (vedi punto 2.1), e la cattura viene eseguita con un primer singolo PEC progettato per catturare il prodotto controllo positivo. Se questa reazione viene eseguito il controllo, qPCR con entrambi positivi di controllo specifico e 454 adattatore specifico per coppie di primer può essere usato per quantificare la quantità di 'obiettivo di controllo' contro di fondo nella reazione fondo purificato estensione (1,3), estensione del prodotto Primer (2,3 ) ed eluita prodotto di acquisizione tallone (3,6). In questo modo, sia l'efficacia della rimozione di fondo ("specificità") e l'efficienza di recupero di destinazione ("sensibilità") nella vostra condizioni sperimentali possono essere misurati direttamente.

Un successo PEC protocollo normalmente ha le seguenti caratteristiche -

Sensibilità (misurata dalla quantità di target di controllo mantenuto attraverso il protocollo):
Importo totale del target di controllo in eluiti prodotto di acquisizione tallone (3,6) = ~ 1-20% del totale in purificato estensione reazione Primer (2,3).

Di fondo (misurata da 454 coppia emPCR primer):
Importo totale di sfondo in eluita prodotto di acquisizione tallone (3,6) <0,01% del totale in reazione fondo purificato estensione (2,3).

Se c'è meno dell'1% del target rimanenti nel prodotto finale, il passo estensione primer può non hanno avuto successo e devono essere esaminati.

Se c'è molto di più dello 0,01% del fondo residuo nei prodotti finali, le fasi di lavaggio potrebbe essere stato erroneamente eseguito e deve essere indagato.

Il metodo di PEC è semplice, veloce, sensibile e specifico. Quindi abbiamo le applicazioni prevedono più autori al di fuori del DNA antico, quali la cattura di piccoli frammenti di RNA da una libreria di RNA, gli interrogatori di variazione strutturale in un campione aggregato o la cattura di 16S (o di altri loci) diversità da un campione metagenomica. Un punto da ricordare è che la sensibilità di cattura si riduce il numero di PEC primer in un multiplex aumenta la cattura di reazione. PEC non è quindi ideale per la cattura delle regioni catturare molto grandi (ad esempio un megabase o più), ma è molto adatto per la cattura delle regioni obiettivo di piccole dimensioni o addirittura posizioni SNP da molti individui in modo rapido.

Ringraziamo M. Meyer per un consiglio; L'Accademia Croata delle Scienze e delle Arti e il Berlino-Brandeburgo Accademia delle Scienze per il supporto logistico e scientifico, e il Fondo per l'Innovazione del Presidente della Max Planck Society per il sostegno finanziario. JMG è stato sostenuto da una borsa post-dottorato internazionale NSF (OISE-0754461). Sequenze sono depositate presso la banca dati EBI nucleotide con i numeri di adesione: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33,25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411

1. Briggs AW, Good JM, Green RE, Krause J, Maricic T, Stenzel U, Lalueza-Fox C, Rudan P, Brajkovic D, Kucan Z, Gusic I, Schmitz R, Doronichev VB, Golovanova LV, de la Rasilla M, Fortea J, Rosas A, Paabo S. Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes. Science 325(5938): 318-321 (2009).
2. Rohland N, Hofreiter M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques 42(3): 343-352 (2007).
3. Rohland N, Hofreiter M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc 2(7) : 1756-1762 (2007).
4. Maricic T, Pääbo S. Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands Biotechniques 46(1): 51-57 (2009).
5. Meyer M, Briggs AW, Maricic T, Hober B, Hoffner B, Krause J, Weihmann A, Paabo S, Hofreiter M. From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing. Nucleic Acids Res 36 (1) e5 (2007).

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