The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Tsien, R. Y. The 2009 Lindau Nobel Laureate Meeting: Roger Y. Tsien, Chemistry 2008. J. Vis. Exp. (35), e1575, doi:10.3791/1575 (2010).
Amerikanische Biochemiker Roger Tsien teilten sich die 2008 der Nobelpreis in Chemie mit Martin Chalfie und Osamu Shimomura für die Entdeckung und die Entwicklung des Green Fluorescent Protein (GFP). Tsien, der in New York wurde 1952 geboren und wuchs in Livingston New Jersey, begann im Keller des Hauses der Familie in jungen Jahren zu experimentieren. Von wachsender Kieselsäure Gärten bunter kristallisiert Metallsalze zu versuchen, Aspirin zu synthetisieren, angeheizt diesen frühen Experimenten, was Tsiens lebenslanges Interesse an der Chemie und Farben zu werden.
Tsien erste offizielle Labor Erfahrung war ein NSF-gestützte Sommer Forschungsprogramm, in dem er mit Hilfe von Infrarotlicht zu untersuchen, wie Metalle, Thiocyanat zu binden, für die er ein $ 10.000 Stipendium in der Westinghouse Science Talent Search verliehen. Nach seinem Abschluss an der Harvard im Jahre 1972, besuchte Tsien Cambridge University in England unter einem Marshall-Stipendium. Dort lernte er die organische Chemie - ein Thema, das er als Student gehasst hatte - und suchte nach einem Weg, um Farbstoffe für die Bildgebung neuronaler Aktivität zu synthetisieren, Erzeugung BAPTA basierten optischen Calcium-Indikator-Farbstoffe.
Nach dem Abschluss seiner Postdoc-Zeit in Cambridge im Jahre 1982 angenommen Tsien eine Fakultät an der Universität of California, Berkeley. Da ist er und seine Kollegen entwickelt und verbessert viele kleine Molekül, einschließlich der Indikatoren Fura-2 und Indo-1.
In 1989 wechselte Tsien seinem Labor an der University of California in San Diego, wo er und seine Kollegen entwickelten die verbesserte Mutante von GFP als eine Möglichkeit, ein zyklisches AMP (cAMP)-Sensor für den Einsatz in lebenden Zellen zu entwickeln. Sie zunächst technisch-Moleküle, die Vorteile der Konformationsänderung, dass, wenn cAMP bindet an die Proteinkinase A (PKA) tritt zu nehmen. Durch die Kennzeichnung eines Teils der PKA mit Fluorescein und ein weiteres mit einem Rhodamin, hofften sie, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), die auftreten, wenn die beiden Moleküle wurden in der Nähe erkennen würde. Die ersten Experimente präsentiert zahlreiche Schwierigkeiten aufgrund der Herausforderungen der Ausdruck PKA-Untereinheiten in E. coli, die Kennzeichnung des Proteins ohne Zerstörung ihrer Funktion und liefert das Protein an Zellen via Mikroinjektion.
Schließlich suchte Tsien eine elegante Methode, in der Hoffnung zu verwenden und zu modifizieren ein natürlich fluoreszierendes Protein, das in der Zelle exprimiert werden konnte. GFP ursprünglich von Davenport im Jahr 1955 beschrieben, extrahiert und durch Shimomura gereinigt in 1965, und kloniert durch Prasher im Jahr 1992 wurde eine ansprechende Kandidaten. Um das Protein mehr nützlich für ihr Studium FRET, Tsien und seine Kollegen die Aminosäure-Struktur des Proteins (S65T) modifiziert. Die verbesserte Protein hatte eine Anregung Spitze nahe, dass der Fluorescein und wurde photostabil. Tsien und seine Kollegen auch das Protein die Kristallstruktur gelöst, so dass sie, um zusätzliche Farben mit spektralen Eigenschaften eignet sich für FRET zu generieren. Allerdings, wenn sie die GFP-Proteine in der Detektion von cAMP verwenden wollte, erlebte sie weitere Schwierigkeiten mit PKA. Stattdessen war es der erste erfolgreiche Einsatz von GFP-Derivate für FRET bei der Erkennung von intrazellulären Calcium mit ihren technisch Calmodulin-basierte Kalzium-Indikator, Cameleon.
In kurzer Zeit hat Tsien Arbeit führte zu technologischen Entwicklungen und wichtigen wissenschaftlichen Erkenntnissen weiter. GFP und seine Derivate haben in einer Vielzahl von biologischen Anwendungen eingesetzt, von der Untersuchung von Protein-Lokalisierung zu verstehen, wie HIV von Zelle zu Zelle ausbreitet. Die Notwendigkeit einer solchen Sonden wird durch die Fülle von Forschungsarbeiten mit Hilfe dieser fluoreszierenden Proteine, sowie die Weiterentwicklung von ähnlichen fluoreszierende Proteine, wie die Korallen-derived dsRED hervorgehoben.
Tsien entwickelt derzeit genetisch kodierte Infrarot fluoreszierenden Proteinen (IFPS), die mit ihren langen Emissionswellenlängen von> 700 nm, haben die Fähigkeit, durch lebendes Gewebe passieren und zu verbessern Bildgebung in lebenden Organismen. Er baut auch synthetische Moleküle für den Einsatz beim Menschen. Er zitiert Teamleistung und die Beiträge der Studenten und Post-Docs als Schlüsselkomponenten für Fortschritt und Erfolg: "Selbst wenn ich die Zeit hatte, konnte ich nicht die Experimente gemacht haben, weil ich nicht wissen, wie es ist sehr viel ein. Teamleistung. "
