The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Tsien, R. Y. The 2009 Lindau Nobel Laureate Meeting: Roger Y. Tsien, Chemistry 2008. J. Vis. Exp. (35), e1575, doi:10.3791/1575 (2010).
Bioquímico estadounidense Roger Tsien compartieron el Premio Nobel 2008 en Química con Martin Chalfie y Osamu Shimomura para su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente (GFP). Tsien, nacido en Nueva York en 1952 y creció en Livingston New Jersey, comenzó a experimentar en el sótano de la casa de la familia a una edad temprana. De los jardines de sílice cada vez mayor de colorido las sales de metales cristalizados a intentar sintetizar la aspirina, estos primeros experimentos impulsado lo que sería de interés para toda la vida de Tsien en la química y los colores.
Primera experiencia de laboratorio de Tsien oficial era un programa de verano de la NSF, apoya la investigación en la que utiliza la espectroscopía infrarroja para examinar cómo los metales se unen a tiocianato, para lo cual se le concedió una beca de $ 10,000 en la Búsqueda de Talento Westinghouse Science. Después de graduarse de la Universidad de Harvard en 1972, asistió a Tsien Universidad de Cambridge en Inglaterra con una beca Marshall. Allí se enteró de la química orgánica - un tema que él había odiado cuando era estudiante - y buscó una manera de sintetizar colorantes para la actividad neuronal de imágenes, generación de BAPTA colorantes basados en óptica indicador de calcio.
Tras la finalización de su formación posdoctoral en Cambridge en 1982, Tsien aceptó un puesto docente en la Universidad de California, Berkeley. Allí, él y sus colegas desarrollaron y mejora de numerosos indicadores de pequeñas moléculas, incluyendo los indicadores de fura-2 y la indo-1.
En 1989, Tsien se trasladó su laboratorio a la Universidad de California en San Diego, donde él y sus colegas desarrollaron la mayor mutante de GFP como una manera de concebir un AMP cíclico (AMPc) sensor para su uso en células vivas. Inicialmente diseñado moléculas de aprovechar el cambio conformacional que se produce cuando cAMP se une a la proteína quinasa A (PKA). Al etiquetar una parte de la PKA, con fluoresceína y otra con rodamina, esperaban detectar transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), que se produciría cuando las dos moléculas se encontraban en las proximidades. Los experimentos iniciales presentan numerosas dificultades debido a las dificultades de expresión de las subunidades de PKA en E. coli, el etiquetado de la proteína sin destruir su función, y la entrega de la proteína a las células a través de la microinyección.
Con el tiempo, Tsien buscó un enfoque más elegante, con la esperanza de usar y modificar una proteína fluorescente que, naturalmente, podría expresarse en la célula. GFP originalmente descrito por Davenport en 1955, extraída y purificada por Shimomura en 1965, y se clonaron por Prasher en 1992 era un candidato atractivo. Para hacer que la proteína sea más útil para sus estudios de FRET, Tsien y sus colegas modificaron la estructura de aminoácidos de la proteína (S65T). La proteína había mejorado un pico de excitación cercana a la de fluoresceína, y se fotoestable. Tsien y sus colegas también resolver la estructura de la proteína de cristal, lo que les permite generar colores adicionales con propiedades espectrales adecuados para FRET. Sin embargo, cuando trató de utilizar las proteínas GFP en la detección de cAMP, que experimentaron mayores dificultades con PKA. En cambio, su primer uso acertado de los derivados de las buenas prácticas agrarias para FRET se encontraba en la detección de calcio intracelular con su ingeniería calmodulina indicador basado en calcio, Cameleon.
En poco tiempo, el trabajo de Tsien ha dado lugar a nuevos avances tecnológicos e importantes descubrimientos científicos. GFP y sus derivados han sido utilizados en una amplia gama de aplicaciones en biología, desde el estudio de la localización de la proteína para entender cómo el VIH se propaga de célula a célula. La necesidad de estas sondas se destaca por la abundancia de la investigación llevada a cabo utilizando estas proteínas fluorescentes, así como el desarrollo continuo de las proteínas fluorescentes similares, como el coral DsRed derivados.
Tsien está desarrollando genéticamente codificados proteínas fluorescentes de infrarrojos (PAI), que con sus longitudes de onda de emisión a largo de> 700 nm, tienen la capacidad de pasar a través de los tejidos vivos y mejorar la imagen de los organismos vivos. Él es también la construcción de moléculas sintéticas para uso en humanos. Cita esfuerzo de equipo y las contribuciones de los estudiantes y post-doctorado como componentes clave del progreso y el éxito: "Incluso si tuviera tiempo, yo no podría haber hecho los experimentos, porque no sé cómo es en gran medida una. esfuerzo de equipo ".
