The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Tsien, R. Y. The 2009 Lindau Nobel Laureate Meeting: Roger Y. Tsien, Chemistry 2008. J. Vis. Exp. (35), e1575, doi:10.3791/1575 (2010).
Biochimico statunitense Roger Tsien condiviso il Premio Nobel 2008 per la Chimica con Martin Chalfie e Osamu Shimomura per la loro scoperta e lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP). Tsien, nato a New York nel 1952 ed è cresciuto a Livingston nel New Jersey, cominciò a sperimentare nel seminterrato della casa di famiglia in giovane età. Dai giardini di silice crescente di sali metallici colorati cristallizzato per tentare di sintetizzare aspirina, questi primi esperimenti alimentato quello che sarebbe diventato permanente Tsien interesse in chimica e colori.
Prima esperienza Tsien è stato un laboratorio ufficiale NSF programma sostenuto ricerca estivo in cui ha usato la spettroscopia a infrarossi per esaminare come i metalli si legano ai tiocianato, per la quale è stato premiato con una borsa di studio 10.000 dollari in Ricerca Westinghouse Science Talent. Dopo la laurea ad Harvard nel 1972, Tsien frequentato l'Università di Cambridge in Inghilterra con una borsa di studio Marshall. Ci ha imparato chimica organica - un soggetto che aveva odiato come studente universitario - e cercava un modo per sintetizzare coloranti per l'attività di imaging neuronale, generando Bapta base ottico coloranti indicatore di calcio.
A seguito del completamento della sua formazione post-dottorato a Cambridge nel 1982, Tsien ha accettato una posizione di facoltà presso la University of California, Berkeley. Lì e colleghi hanno sviluppato e migliorato numerosi indicatori piccola molecola, compresi gli indicatori Fura-2 e indo-1.
Nel 1989, Tsien trasferì il suo laboratorio alla University of California a San Diego, dove lui ei suoi colleghi hanno sviluppato il mutante avanzata del GFP come un modo per concepire un AMP ciclico (cAMP), sensore per l'uso in cellule vive. Inizialmente hanno progettato le molecole di sfruttare il cambiamento conformazionale che si verifica quando cAMP si lega alla proteina chinasi A (PKA). Mediante l'etichettatura una parte di PKA con fluoroscein e un altro con un rodamina, che speravano di rilevare Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), che si verificano quando le due molecole sono nelle immediate vicinanze. Gli esperimenti iniziali presentato numerose difficoltà a causa della difficoltà di esprimere subunità PKA in E. coli, la proteina etichettatura senza distruggere la sua funzione, e consegna la proteina nelle cellule tramite microiniezione.
Alla fine, Tsien ha cercato un approccio più elegante, sperando di usare e modificare una proteina fluorescente che può essere espressa nella cellula. GFP originariamente descritto da Davenport nel 1955, estratto e purificato da Shimomura nel 1965, e clonato da Prasher nel 1992 è stato un candidato attraente. Per rendere la proteina più utili per i loro studi FRET, Tsien e colleghi hanno modificato la struttura degli aminoacidi della proteina (S65T). La proteina migliorata ha avuto un picco di eccitazione vicino a quella di fluoroscein, ed è stato fotostabili. Tsien e colleghi hanno anche risolto la struttura cristallina della proteina, permettendo loro di generare colori supplementari con proprietà spettrali adatte per FRET. Tuttavia, quando hanno tentato di utilizzare le proteine GFP nella rilevazione di cAMP, hanno vissuto ulteriori difficoltà con PKA. Invece, il loro primo utilizzo successo di derivati FRET GFP è stato per il rilevamento di calcio intracellulare mediante la loro progettato calmodulina-based indicatore di calcio, Cameleon.
In breve tempo, il lavoro Tsien ha portato ad ulteriori sviluppi tecnologici e importanti scoperte scientifiche. GFP e dei suoi derivati sono stati utilizzati in una vasta gamma di applicazioni biologiche, dallo studio della localizzazione delle proteine per capire come l'HIV si diffonde da cellula a cellula. La necessità di tali sonde è evidenziato per l'abbondanza di ricerche condotte utilizzando queste proteine fluorescenti, così come lo sviluppo di simili proteine fluorescenti, come il corallo derivati DsRed.
Tsien sta attualmente sviluppando geneticamente codificato Proteine fluorescenti a raggi infrarossi (IFPS), che con la loro lunghezza d'onda lunga di emissione> 700 nm, hanno la capacità di passare attraverso i tessuti viventi e migliorare l'immagine negli organismi viventi. E 'anche la costruzione di molecole sintetiche per l'uso nell'uomo. Egli cites lavoro di squadra ed i contributi degli studenti e dei post-doc come componenti chiave del progresso e successo: "Anche se ho avuto il tempo, non ho potuto fare gli esperimenti, perché io non so come 'molto tanto una. squadra sforzo. "
