ऊतक इंजीनियरिंग और सेल संस्कृति के लिए रेशेदार पॉलिमर scaffolds Electrospinning

ए सिंगल पॉलिमर Electrospinning

1. Electrospinning समाधान तैयार करने से पहले, विआयनीकृत जल में 37 पर कई दिनों के लिए डिग्री सेल्सियस भंग करके photoinitiator के एक 0.5% wt समाधान, 2959 Irgacure (I2959), बनाते हैं. अगर एक photoreactive बहुलक का इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है यह चरण आवश्यक नहीं है.
2. कम्बाइन methacrylated hyaluronic एसिड (MeHA, Burdick एट अल संश्लेषण के लिए देख), पाली (ethylene ऑक्साइड) (PEO, 900 केडीए), और I2959 विआयनीकृत जल में 2% wt MeHA, 3% wt के अंतिम एकाग्रता के साथ एक समाधान तैयार PEO, और 0.05% wt I2959. एक भंवर उपयोग के समाधान के मिश्रण जब तक यह स्पष्ट है. बहुलक प्रकार और एकाग्रता के रूप में अच्छी तरह से विलायक इस्तेमाल किया इस कदम पर वांछित पाड़ गुणों पर निर्भर करता है संशोधित किया जा सकता है.
3. एक सिरिंज में समाधान स्थानांतरण और अंत में एक 18 गेज, 6 इंच लंबी, कुंद अंत सुई देते.
4. कार्यक्रम एक सिरिंज पंप के लिए 1.2 एमएल / घंटा की दर से बेदखल करना. डिवाइस में सिरिंज और सुई डालें.
5. संग्रह तंत्र के लिए एक उच्च वोल्टेज बिजली के स्रोत के जमीन का नेतृत्व संलग्न. करने के लिए इकट्ठा बेतरतीब ढंग से वितरित फाइबर एक फ्लैट धातु प्लेट का उपयोग करें, या ~ m / s 10 घूर्णन गठबंधन फाइबर इकट्ठा खराद का धुरा का उपयोग करें. सुई सकारात्मक आरोप लगाया नेतृत्व संलग्न. Electrospinning तंत्र के एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें.
6. सुई या एकत्रित डिवाइस, ऐसी है कि वहाँ दोनों के बीच 15 सेमी की दूरी समायोजित करें.
7. सिरिंज पंप पर प्रवाह को प्रारंभ करें. जब तरल पदार्थ सुई की नोक पर कल्पना है, शक्ति के स्रोत पर बारी और 22 केवी वोल्टेज सेट.
8. बाद संग्रह पूरा हो गया है (पतली फिल्मों के लिए कई मिनट से एक मोटा चटाई के लिए 24 घंटे के लिए), संग्रह तंत्र से पाड़ हटा दें और इसे वैक्यूम के अंतर्गत स्टोर करने के लिए विलायक का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए रातोंरात.
9. कल्पना फाइबर आकारिकी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग करने के लिए, एक प्रतिनिधि पाड़ दोनों गठबंधन और निर्गुट संरचनाओं के लिए चित्र 1 में दिखाया गया है.

नोट: नमूना प्रवाह दर, संग्रह डिवाइस के लिए दूरी, और वोल्टेज बहुलक और विलायक संयोजन पर निर्भर हैं और प्रत्येक प्रणाली के लिए SEM साथ पाड़ आकारिकी देख कर आम तौर पर, अनुकूलित किया जाना चाहिए.

बी Photocrosslinking और Photopatterning

1. पाड़ चटाई से बाहर 5mm एक्स 5mm नमूने कट.
2. प्रत्येक पाड़ एक गिलास स्लाइड कवर पन्नी पर रखकर, सीधे photomask पाड़ पर रखने, एक साफ गिलास स्लाइड के साथ कवर और बांधने की मशीन क्लिप के साथ दोनों सिरों कतरन द्वारा crosslinking के लिए तैयार है. नोट: चार नमूने एक ही बार में किया जा सकता है, और एक पैटर्न के बिना एक पारदर्शिता crosslinking के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक पैटर्न वांछित नहीं है.
3. पर्ज पाड़ एक नाइट्रोजन कक्ष में स्थापित. यह महत्वपूर्ण है निर्माण करने के लिए ऑक्सीजन, जो crosslinking को बाधित कर सकते हैं से मुक्त रखने के.
4. प्लेस ~ 10 मेगावाट सेमी / ² 5 मिनट के लिए एक collimating एडाप्टर के साथ 365 एनएम प्रकाश के तहत नाइट्रोजन कक्ष में पाड़ सेटअप . चित्रा 2 में योजनाबद्ध देखें.
5. प्रत्येक पाड़ और एक 12 अच्छी तरह से थाली में जगह निकालें.
6. प्रत्येक अच्छी तरह से, parafilm 37 ° 24 घंटे के लिए सी में पानी और जगह के वाष्पीकरण को रोकने की थाली में विआयनीकृत पानी की 2 एमएल जोड़ें. तीन बार पानी बदलें.
7. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ताकना गठन (चित्रा 2 में उदाहरण देखें) कल्पना. scaffolds अब कर रहे हैं उपयोग के लिए तैयार हैं.

नोट: Photocrosslinking आवश्यक पॉलिमर के कई प्रकार के के लिए, लेकिन photopatterning केवल photoreactive पॉलिमर के साथ प्रयोग किया जा सकता है नहीं है.

सी. प्रतिदीप्त फाइबर विज़ुअलाइज़ेशन के साथ दोहरी पॉलिमर Electrospinning

1. 90% इथेनॉल में PEO (200 केडीए) की एक 5% wt समाधान तैयार करें. 50 डिग्री से पहले electrospinning कम से कम 2 घंटे के लिए सी 700 rpm पर हिलाओ.
2. एक सिरिंज PEO समाधान स्थानांतरण और DAPI electrospinning समाधान में एक 10 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़. लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में यह प्रकाश से बचाने सिरिंज.
3. एक ही कदम A2 में भी छोड़कर electrospinning समाधान में 25 सुक्ष्ममापी की अंतिम एकाग्रता के लिए methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine बी (MeRho, 683.24 छ / mol) जोड़ने, वर्णित समाधान तैयार करें. लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में यह प्रकाश से बचाने सिरिंज.
4. ध्यान स्कॉच टेप का उपयोग करें खराद का धुरा की सतह methacrylated कांच coverslips (Khademhosseini एट अल देखें.) सुरक्षित हैं. नोट: फाइबर methacrylated कांच coverslips करने के लिए सीमित हो जाएगा.
5. 5 मिमी सिलिकॉन टयूबिंग की लंबी luer ताला अनुलग्नकों के साथ एक सीरिंज के टुकड़ा के एक छोर संलग्न और एक सुई के दूसरे छोर संलग्न. सिरिंज पंप में सिरिंज डालें और ओसाने की मशीन में छेद के माध्यम से सुई डाल दिया. अन्य और खराद का धुरा के विपरीत साइट पर सिरिंज ओसाने की मशीन के साथ दोहराएँ. fanners एल अनुवादखराद का धुरा के ength और दोनों पॉलिमर के परिणामस्वरूप पाड़ में एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है. चित्रा 3 में योजनाबद्ध देखें.
6. खंड में वर्णित एक उचित तालिका 1 के अनुसार पैरामीटर समायोजित करें. सुनिश्चित करें कि सुई सुझावों खराद का धुरा पर केंद्रित कर रहे हैं.
   
   तालिका 1. दोहरी पॉलिमर Electrospinning पैरामीटर्स
   

   सिरिंज	ओसाने की मशीन के लिए सुई टिप (सेमी)	खराद का धुरा (सेमी) के लिए सुई टिप	फ्लो दर (एमएल / घंटा)	एप्लाइड वोल्ट (केवी)
   MeHA	6	15	1.2	22
   PEO	6	10	1.2	15

   
   
7. एक बार सब कुछ ठीक से गठबंधन है, बंद रोशनी बारी और खराद का धुरा और सिरिंज पंप पर बारी. सीरिंज से एल्यूमीनियम पन्नी निकालें. जब द्रव दोनों सुइयों के सुझावों पर दिखाई देता है, साथ ही fanners में बिजली की आपूर्ति और प्लग पर बारी.
8. जब संग्रह पूरा हो गया है, बिजली की आपूर्ति और खराद का धुरा बारी और fanners हाल चलाना. ध्यान से coverslips और टेप एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर हटा दें.
9. कल्पना एक फ्लोरोसेंट rhodamine और DAPI के लिए फिल्टर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग कर फाइबर. चित्रा 3 में उदाहरण देखें. नोट: प्रतिदीप्त फाइबर सबसे स्पष्ट कर रहे हैं को देखने के लिए जब समय का संक्षिप्त अवधि (<3 मिनट) के लिए electrospun, तथापि, इस प्रक्रिया को समय की एक असीमित राशि के लिए बढ़ाया जा सकता है क्रम में मोटा constructs कांच coverslips के उपयोग के बिना विशेष रूप से, बनाने .

डी. scaffolds पर सीडिंग कक्ष

1. एक उचित आकार अच्छी तरह से थाली के एक व्यक्ति को अच्छी तरह से में संलग्न electrospun बहुलक के साथ प्रत्येक coverslip रखें. नोट: फाइबर के साथ सेलुलर बातचीत methacrylated कांच coverslips पर electrospinning द्वारा आसानी से दिखाई दे रहे हैं. इसके अलावा, MeRho फिर फाइबर दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. पीबीएस में scaffolds रातोंरात सेते विलायक का पूरी तरह हटाने और उत्पादों के द्वारा किसी भी संभव leachable सुनिश्चित है.
3. कुओं से पीबीएस निकालें.
4. Scaffolds बाँझ, उन्हें 30 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में एक germicidal दीपक के तहत जगह है. यदि एक पूर्ण पाड़ वरीयता प्राप्त किया जा रहा है, एक और 30 मिनट के लिए एक germicidal दीपक के तहत पाड़ और जगह फ्लिप.
5. प्रदर्शन मानक सेल संस्कृति और वांछित सेल घनत्व पर केंद्रित सेल निलंबन तैयार (जैसे, ६००० कोशिकाओं सेमी ^-2). उदाहरण के लिए, एक 22 मिमी एक्स 22 मिमी coverslip के लिए सेल निलंबन के 100 एमएल का उपयोग करें. इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए रखें.
6. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया की उचित राशि जोड़ें. इनक्यूबेटर में scaffolds वापस प्लेस.
7. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइव / मृत किट का उपयोग कोशिकाओं दाग. नोट: सेल धुंधला DAPI (सेल नाभिक) और fluorescently लेबल phalloidin (actin तनाव फाइबर) के रूप में अन्य प्रकार, कोशिकाओं कल्पना करने के लिए लागू किया जा सकता है.
8. कोशिकाओं और एक फ्लोरोसेंट TRITC और FITC के लिए फिल्टर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग कर फाइबर कल्पना. चित्रा 4 में उदाहरण देखें.

प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1 निर्गुट पाड़ (ऊपर) के गठन और संरेखित पाड़ गठन (नीचे) के लिए डिवाइस योजनाबद्ध illustrating सेटअप . उदाहरण पाड़ के प्रत्येक प्रकार की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों से पता चला रहे हैं. स्केल बार = 5μm. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 2 patterning विधि के योजनाबद्ध. पैटर्न photocrosslinking के दौरान प्रकाश स्रोत और पाड़ के बीच एक photomask रखने और फिर दूर unreacted बहुलक धोने का गठन कर रहे हैं. ताकना गठन और lyophilization के बाद scaffolds के Photomask और SEM छवि. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

चित्रा 3 बहु बहुलक electrospinning सेटअप और आवश्यक प्रसंस्करण मापदंडों के योजनाबद्ध रूप में अच्छी तरह के रूप में दो फाइबर (उदाहरण: - लाल MeHA और नीले PEO) आबादी का एक मिश्रण के एक प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवि जो एक साथ electrospun थे एक बहु बहुलक पाड़ फार्म . स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी. कृपया यहाँ क्लिक करने के लिए एक बड़ा versio देखचित्रा 3 का पता.

चित्रा 4. एक उदाहरण लाइव / मृत मानव mesenchymal स्टेम सेल और electrospun फाइबर के साथ उनकी बातचीत के धुंधला छवि. स्केल बार = 100 सुक्ष्ममापी. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 4 का एक बड़ा संस्करण देख.

Electrospinning पॉलिमर से रेशेदार scaffolds तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Photocrosslinkable hyaluronic एसिड पर आधारित थे एक उदाहराणदर्शक उदाहरण के लिए, जहां प्रकाश जोखिम crosslinking के लिए की जरूरत है के रूप में इस्तेमाल किया scaffolds. MeHA जैसे प्रतिक्रियाशील macromers के उपयोग के साथ, चैनलों कि पहले बढ़ाया सेलुलर वितरण का प्रदर्शन किया है scaffolds में photocrosslinking के दौरान एक मुखौटा का उपयोग स्थूल और सूक्ष्म झरझरा scaffolds के फार्म के साथ शामिल थे. इसके अलावा, एक साथ दो अलग पॉलिमर हमारे कस्टम उपकरण का उपयोग कर electrospun थे. एक फ्लोरोसेंट रंजक के प्रत्येक electrospinning समाधान है, जो बाद में एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कर देखा गया था के अलावा के साथ दो अलग फाइबर आबादी की उपस्थिति सत्यापित किया गया था. मल्टी - बहुलक scaffolds के सेलुलर वितरण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बेहतर यांत्रिकी और एक विशेष एकल बहुलक electrospun scaffolds के सापेक्ष आवेदन के लिए एक पाड़ की गिरावट धुन बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, नसबंदी और scaffolds के सेल बोने का प्रदर्शन किया गया है. इन तकनीकों में से कई बहुमुखी हैं और विभिन्न पॉलिमर की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ऊतक इंजीनियरिंग में अनुप्रयोगों के लिए और कोशिकाओं की संस्कृति के लिए विविध scaffolds बनाना.