JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

1, 1, 1

1Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 23.22.83.105, User IP: 23.22.83.105, User IP Hex: 387339113

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Date Published: 2/25/2007, Issue 2; doi: 10.3791/159

    Cite this Article

    LeBlanc, J., Venezia Bowman, T., Zon, L. Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (2), e159, doi:10.3791/159 (2007).

    Abstract

    الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) هي نادرة السكان من الخلايا المحفزة التي تحافظ على جميع الأنساب المتباينة الدم طوال حياة الكائن الحي. تعريف وظيفي للشهادة الثانوية العامة هي خلية زرع أن لديه القدرة على إعادة جميع الأنساب دم مصطلح المتلقي المشع طويلة. تأسست هذه التسمية من قبل عقود من العمل المنوي في نظم الثدييات. زرع الخلايا المكونة للدم تستخدم (HCT) والتلاعبات الجينية العكسية في الماوس ، والعوامل الكامنة وراء التنظيمية البيولوجيا شهادة الثانوية العامة هي بداية لكشف النقاب عن أن تكون ، ولكن لا تزال الى حد كبير في إطار استكشاف. في الآونة الأخيرة ، برزت الزرد نموذجا لدراسة جينية قوية تكون الدم الفقاريات. وإنشاء كليات التقنية العليا في الزرد تسمح للعلماء للاستفادة من المنهجيات واسعة النطاق الفحص الجيني والكيماوية المتوفرة في الزرد للكشف عن الآليات الكامنة وراء تنظيم رواية HSC. في هذه المقالة ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لأداء كليات التقنية العليا في الزرد الكبار. نظهر للتشريح وإعداد الزرد نخاع الكلى كله ، تكون الدم في موقع الكبار في الزرد ، وإدخال هذه الخلايا المانحة إلى الدورة الدموية للأسماك المشع المتلقي عن طريق الحقن داخل القلب. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن تصف الرعاية اللاحقة للزرع من الأسماك في "العناية المركزة" لزيادة قدرتها على الصحة على المدى الطويل. في رعاية عامة لطيف من الأسماك قبل وأثناء وبعد عملية الزرع أمر بالغ الأهمية لزيادة عدد الأسماك التي سوف البقاء على قيد الحياة أكثر من الشهر التالي للإجراءات ، وهو أمر أساسي لتقييم المدى الطويل (<لمدة 3 أشهر) engraftment. وسيتم نشر البيانات التجريبية المستخدمة لإنشاء هذا البروتوكول في مكان آخر. فإن إنشاء هذا البروتوكول يسمح للاندماج الجينات الزرد على نطاق واسع والبيولوجيا زرع.

    Protocol

    إشعاع

    1. أشرق في وزن الأسماك 25Gy 2 قبل أيام من زرع

    تشريح الكلى

    1. التضحية العدد المناسب من الجهات المانحة في tricaine فلوري (~ 100ML 4mg/ml Tricaine / لتر من أسماك المياه) (متوسط ​​500،000 خلية لكل الأسماك المانحة)
    2. عزل الكلى في برنامج تلفزيوني 0.9X + 5 ٪ + 1 ٪ FCS بن بكتيريا ("PBS +") في أنبوب
    3. تفريق مع الماصة 1ml ، ثم مع المحاقن مع إبرة 10ML G 18 02/01
    4. نقل إلى 50mL المخروطية وتمتلئ PBS +
    5. تدور باستمرار @ 1500rpm 8min
    6. أسكب ، resuspend بيليه في حجم كبير وتصفيتها من خلال تصفية 40micron
    7. تدور باستمرار @ 1500rpm 8min
    8. أسكب ، في برنامج تلفزيوني resuspend 1ml + ، ونقل إلى أنبوب إيبندورف
    9. العد : 10ul الخلية سول + 90ul التريبان الأزرق (الآن هو تخفيفه 10X)
    10. 10ul الخلية سول + 90ul PBS + (الآن هو تخفيفه 10X)
    11. اسمحوا الوقوف 5 دقائق ، إضافة إلى سول 10ul كلا جانبي عدادة الكريات
    12. عدد الخلايا في المربع الكبير (5x5) ، وحساب النسبة المئوية لموت إذا هامة
    13. خلايا / مل = (خلايا) (10 4) (X10 يخفف عامل)

      سبيل المثال -- 60 خلايا تعول على عدادة الكريات هي مجموع الخلايا 6000000

    14. تدور باستمرار عينة @ 1500rpm 8min
    15. حساب حجم لتكوير resuspend في الحصول على تركيز مناسب من الخلايا
    16. اجمالى حجم 5ul لحقن -- 3ul WKM يجري ويجري الدم المحيطي 2ul
    17. مثلا -- ومجموع الخلايا 6000000

      تريد زرع الخلايا في المتلقي 200000

      لدينا 20 المستلمين

      نريد 66667 خلية / UL (200000 خلية / 3ul)

      resuspend بيليه في 90ul (6000000 خلية / خلايا 66667 / UL)

      تحتاج فقط عن 60ul من أن (س 20recip 3ul)

    استخراج الدم المحيطية

    1. التضحية العدد المناسب من الأسماك في WT tricaine (~ 100ML 4mg/ml Tricaine / ليتر من الماء الأسماك) للدم الحامل (متوسط ​​2000000 الخلايا لكل من الجهات المانحة)
    2. تخثر : 1ul تمييع (3unit/ul) في برنامج تلفزيوني 1mL +
    3. معطف طرف الماصة مع الهيبارين ، وطعنة من خلال الخياشيم مع طرف الماصة ، إضافة إلى برنامج تلفزيوني الدم +
    4. تدور 1500rpm 5min ، resuspend في 1.5mL
    5. تدور 1500rpm 5min ، resuspend في 1mL
    6. من خلال فلتر تصفية 40micron
    7. عدد الخلايا على النحو الوارد أعلاه
    8. خلايا / مل = (خلايا) (10 4) (X10 يخفف عامل)
    9. حساب للموت
    10. حساب حجم إعادة تعليق على النحو الوارد أعلاه

    حقن

    1. حقن 5ul في قلب كل مستلم باستخدام حقنة هاميلتون
    2. تخدير الأسماك في tricaine (4.2ml (4mg/ml) أسماك المياه Tricaine / 100ML) ووضعت على اسفنجة رطبة
    3. إدراج غيض قليلا وراء القلب
    4. كزة حول منطقة القلب حتى تشاهد انفجار صغيرة من الدم (مما يعني ضرب قلب) -- قد> لا نرى هذا ولكن على أي حال حقن

    ICU السمك -- بعد الحقن

    1. إبقاء الأسماك قبالة تدفق لل1 أسبوع لتجنب العدوى
    2. وضع الأسماك في الأقفاص 50-10
    3. إزالة الموتى والاحتفاظ بسجل
    4. يدويا تغيير المياه كل يوم

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter