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アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

, ,

Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

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Cite this Article: アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

LeBlanc, J., Venezia Bowman, T., Zon, L. Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (2), e159, doi:10.3791/159 (2007).

Abstract: アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

造血幹細胞（HSC）は、生物の生活全体のすべての差別化された血液の系統を維持する多能性細胞の珍しい集団である。 HSCの機能定義を再構成照射受信長期のすべての血の系譜をする能力を有し、移植細胞である。この指定は、哺乳動物系における精液の仕事の十年によって設立されました。造血細胞移植（HCT）およびマウスにおける逆遺伝学的操作を使用して、HSC生物学の基盤となる調節因子が発表され始めているが、まだ大部分の下に、検討されています。最近、ゼブラフィッシュは、脊椎動物の造血を研究する強力な遺伝的モデルとして登場しました。ゼブラフィッシュでHCTを確立することは科学者がHSC規制の基礎となる新たなメカニズムを明らかにするためにゼブラフィッシュで利用可能な大規模な遺伝学的および化学的スクリーニングの手法を活用することができます。この記事では、成人のゼブラフィッシュでHCTを実行する方法を示しています。我々は解剖と準備ゼブラフィッシュ全体腎臓、骨髄の、ゼブラフィッシュにおける成人造血のサイト、および心臓内注射を介して照射したレシピエント魚の循環にこれらのドナー細胞の導入を示しています。さらに、我々は、彼らの長期的な健康を高めるために、"ICU"で魚の移植後のケアについて説明します。魚の一般的な、穏やかなケアの中に、前、そして後の移植は、長期の評価（<3月）移植に不可欠な一ヶ月以上の次の手順を、存続する魚の数を増やすことが重要です。このプロトコルを確立するために使用される実験データは別の場所に公開されます。このプロトコルの確立は、大規模なゼブラフィッシュの遺伝学と移植の生物学の合併が可能になります。

Protocol: アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

照射

  1. 移植前に25Gy 2日間でWT魚を照射

腎臓の解剖

  1. tricaine（〜100ミリリットル4mg/ml Tricaine /魚の水のリットル）（ドナー魚あたり500,000個の細胞の平均）で蛍光ドナーの適切な数を生け贄に捧げる
  2. チューブに0.9 PBS +5％FCS + 1％ペン連鎖球菌（"PBS +"）に腎臓を隔離
  3. 18 1 / 2 Gの針と10mlの注射器とし、1mlのピペットで分割
  4. 円錐50mLの中に移し、PBSで一杯に+
  5. @ 1500RPM 8分をスピンダウン
  6. 40micronフィルタを介して大規模なボリュームとフィルターで、ペレットを再懸濁しますを注ぐ
  7. @ 1500RPM 8分をスピンダウン
  8. 1ミリリットルのPBSに再懸濁し、注ぐ+、エッペンドルフチュー​​ブに移す
  9. カウントするには：10ulの細胞ゾル+ 90ulトリパンブルー（今では10倍希釈される）
  10. 10ulの細胞ゾル+ 90ul PBS +（今では10倍希釈される）
  11. 血球計算盤のどちらかの側に10ulゾルの両方を追加し、5分放置
  12. 大きなボックス内のセルをカウント（5x5の）、死亡の割合を占める重要な場合
  13. 細胞/ ml =（セル数）（10 4）（X10 DIL。ファクター）

    例 - 60細胞の血球計でカウントは600万セルの合計です

  14. サンプル@ 1500RPMの回転を停止8分
  15. 細胞の適切な濃度を得るためにペレットを再懸濁しますにボリュームを計算する
  16. 注入する5UL総量 - 3ulいるWKMと2ulている末梢血
  17. 例 - 合計600万細胞を持っている

    受信者ごとに20万セルを移植したい

    20受信者を持っている

    66667細胞/ UL（200,000細胞/ 3ul）をしたい

    90ulのペレットを再懸濁します（600万細胞/ 66667細胞/ UL）

    だけの60ul程度を必要とする（20recip X 3ul）

末梢血の抽出

  1. キャリアの血液のためにtricaineのWT魚（魚の水の〜100ミリリットル4mg/ml Tricaine /リットル）の適切な数を生け贄に捧げる（ドナーあたり200万細胞の平均）
  2. 抗凝固剤：1mLのPBSで希釈1UL（3unit/ul）+
  3. ヘパリンでコーティングのピペットチップ、ピペットチップを持つ鰓を通して刺しは、PBSに血液を追加する+
  4. 1.5mlの懸濁する1500RPM 5分を、スピン
  5. 1mLの懸濁する1500RPM 5分を、スピン
  6. 40micronフィルタを通してフィルタ
  7. 上記のようにセルを数える
  8. 細胞/ ml =（セル数）（10 4）（X10 DIL。ファクター）
  9. 死のためのアカウント
  10. 上記のように再懸濁の量を計算する

注射

  1. ハミルトンシリンジを用いて各受信者の心に5ULを注入する
  2. 湿らせたスポンジでtricaineの魚（4.2ミリリットル（4mg/ml）Tricaine / 100ミリリットル魚の水）と場所を麻酔
  3. 少し心の背後にある先端を挿入
  4. もし血液の小さなバーストを（あなたが心を打つという意味）が表示されるまで心臓の辺り周りをウロウロする - >これを見るが、とにかく注入していない可能性があります

魚のICU - ポスト噴射

  1. 感染を避けるために、1週間のためのフローオフ魚キープ
  2. ケージあたり5〜10の魚を置く
  3. 死んで削除し、記録を残す
  4. 手動で毎日水を変える

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