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 JoVE Biology

Voir historique et démonstration de physiologie à l'JNM du muscle Opener écrevisses

1, 1

1Department of Biology, University of Kentucky

Article
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    Summary

    Le muscle de la jambe ouvre écrevisses est présenté pour son importance historique et la polyvalence expérimentale dans le phénotype musculaire, la physiologie synaptique et la plasticité.

    Date Published: 11/09/2009, Issue 33; doi: 10.3791/1595

    Cite this Article

    Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

    Abstract

    Nous présentons ici quelques-unes des découvertes clés importantes faites avec l'ouvreur neuromusculaire (JNM) la préparation de crustacés et d'illustrer qu'il ya encore beaucoup à apprendre de cette préparation du modèle. En compréhension de l'histoire, on peut comprendre pourquoi, même aujourd'hui, cette JNM offre toujours un terrain de jeu riche pour répondre aux questions concernant la fonction de pré-et post-synaptique et la plasticité. La viabilité et la facilité d'accès au terminal pour intracellulaire ainsi que extracellulaire électrophysiologie et d'imagerie sont des avantages importants. Les mécanismes à l'origine de la modulation de la cinétique et la fusion vésiculaire dans les bornes haute et basse-sortie sont la mendicité pour enquête. La préparation propose également un système modèle testable pour les évaluations de calcul et de manipulations d'examiner les principales variables dans les modèles théoriques de la fonction synaptique, par exemple la dynamique de calcium pendant facilitation à court terme. La complexité synaptique de la zone active et la nature statistique de la libération quantique est aussi un espace ouvert pour la future enquête à la fois expérimentalement et numériquement.

    Protocol

    Présentation

    Les jonctions neuromusculaires de crustacés ont fourni d'importantes contributions à la physiologie et plus particulièrement à la physiologie synaptique au cours des années. La facilité de dissection et la viabilité sont probablement les principaux facteurs qui ont favorisé début anatomiste et physiologiste tard d'utiliser les crustacés comme les préparations expérimentales. Ecrevisses en particulier, sont faciles à obtenir à partir des flux d'eau douce et la plus lacs ainsi car ils sont faciles à maintenir dans un environnement de laboratoire par rapport aux crustacés nécessitant un environnement froid et l'eau salée.

    Un zoologiste de retour dans la fin des années 1800 a pris à cœur notamment les espèces de crustacés (ie, écrevisses) et écrit un livre intitulé L'écrevisse ( TH Huxley , 1879). Ce texte a servi de guide sur ces organismes pendant des années et est encore aujourd'hui salué comme un ouvrage complet sur les écrevisses sélective portant sur l'histoire de vie, l'anatomie et la physiologie. Huxley vu l'écrevisse comme un modèle animal de plonger dans les profondeurs de la zoologie dans tous les aspects: ainsi, le caractère global de son livre. Le timing était avantageux que la physiologie a été fleurissent à la fin des années 1880 avec la compréhension de Ringer des ions nécessaires pour maintenir les préparations coeur de grenouille (Ringer, 1882a, b). C'est probablement une des raisons pour que les expériences physiologiques ont progressé rapidement dans d'autres espèces ainsi que les écrevisses. En outre, une solution saline pour maintenir les préparations de crustacés ont été décrits par van Harreveld en 1936.

    Étonnamment l'innervation du muscle dans les jambes ouvre écrevisses a également été caractérisé à cette époque dans l'histoire (Biedermann, 1887). Mais encore plus surprenant est que les études physiologiques étaient déjà en cours dans les muscles de l'écrevisse par Charles Richet en France. En fait, les expériences dans les écrevisses pourraient éventuellement être les premiers à démontrer à la facilitation neuromusculaire (JNM) (Richet, 1879, voir également Richet, 1881). Au cours des prochaines décennies NMJs écrevisses ont été décrites anatomiquement et physiologiquement en ce qui concerne le développement des tensions et l'anatomie (Van Harreveld et Wiersma, 1936).

    L'avènement de l'enregistrement intracellulaire, avec des électrodes pointus (Ling et Gérard, 1949), revitalisé le domaine de l'adresse différentes séries de questions. Les muscles des crustacés étaient connus pour produire des contractions gradué (Katz & Kuffler 1946; Katz, 1949; Wiersma, 1949), mais ce n'est pas avant 1953 que Fatt et Katz enregistrées potentiels transmembranaires de facilitation à court terme dans les fibres musculaires de crabe.

    Le muscle ouvre dans les membres de l'écrevisse a été de nouveau mis en évidence en 1961 lorsque Dudel et Kuffler démontré de facilitation dans ce muscle et a montré pour la 1 ère fois les phénomènes d'inhibition présynaptique (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a). Ils ont également signalé sur la nature quantique de la transmission synaptique à ce JNM (1961b). Au cours des 50 dernières années, il a été un peu d'attention accordée à la préparation et les différentes techniques utilisées pour contrôler la physiologie synaptique. Pour une brève vue d'investigations plus utiliser cette préparation, on commence par noter que l'ensemble du muscle est innervé par un excitateurs et inhibiteurs d'un axone qui pourrait être sélectivement stimulée. Atwood (1964) a démontré avec des trains de stimulation des potentiels postsynaptiques excitateurs facilité et produit la tension musculaire. Iravani (1965) a rapporté sur les différences régionales dans les réponses synaptiques en fonction de la région du muscle. Peu de temps après Dudel (1965a, b) a enregistré des potentiels le long des terminaisons nerveuses de l'ouvre et démontré que la sérotonine neuromodulateur la transmission synaptique améliorée en augmentant la teneur moyenne en quantiques.

    A cette époque, il fut établi que les muscles des crustacés répondu au glutamate et de divers acides aminés ainsi que le GABA (Van Harreveld et Mendelson, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut et al, 1965). Les réponses inhibitrices de GABA a été identifié par Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) et autres (Boistel et Fatt, 1958). Plus tard, le GABA a été isolé et confirmé par Kravtiz (Kravitz et Potter, 1965; Kravitz et al, 1963a, b;. Kravitz, 1962) de l'axone des préparatifs ouvre homard.

    Les muscles des écrevisses offert non seulement des préparations facilement accessible, mais permet d'étudier la manière dont les neurones moteurs identifiables seule peut donner lieu à diverses réponses postsynaptiques au niveau physiologique et structurelles. En particulier le muscle ouvreur est innervée par un neurone moteur excitateur unique, mais le potentiel postsynaptique excitateur (PPSE) à des emplacements différents peut varier de plus de 50 fois dans les fibres superficielles dorsale (Bittner, 1968a, b) et jusqu'à 8 fois plus superficielle ventrale fibres (Iravani, 1965).

    »> Avec le séminal découvrir que le MNJ ouvre les écrevisses exposées facilitation à long terme (LTF) (Sherman et Atwood, 1971), en plus de facilitation à court terme, les fondements mécanistes de ces phénomènes devaient être abordées. Comme un côté Remarque, potentialisation à long terme (LTP) a été découvert dans le cerveau des vertébrés deux ans plus tard (Bliss et L mo, 1973), sans référence à la découverte originale de ce phénomène à la JNM écrevisses. partir de cette période de nombreux chercheurs centré sur les attributs des STF et LTF utilisant la JNM ouvre d'écrevisses à l'étude des mécanismes cellulaires (Atwood, 1973, 1976, 1982; Atwood et al, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner et Sewell, 1976;. Parnas et al, 1982a, b, c, d; Dudel et al, 1983;.. Vyshedskiy et Lin, 1997a, b, c) En outre un point de focalisation a été de comprendre comment un neurone moteur unique qui innervent différentes fibres musculaires sur le muscle ouvreur peut donner lieu à tel variées réponses synaptiques (Linder, 1974; G ¨ nzel et al, 1993;. Govind et al, 1994;. Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman et Atwood, 1972; Zucker, 1974a; Parnas et al, 1982a;. Zucker et Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d).

    Structure synaptique pour rendre compte des réponses différentielles synaptique peut être étudié par analyse ultrastructurale (Jahromi et Atwood, 1974). Mesures des différences ioniques dues à l'activité est en mesure d'être étudiés avec des injections axonale de Ca2 + et Na + indicateurs ainsi que Ca2 + tampons (Mulkey et Zucker 1993;. Winslow et al, 2002), et ces flux peuvent être modélisés dans le terminal (Winslow et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. Adaptations activité dépendante (Atwood et al, 1991.) Et l'identification des types de récepteurs pharmacologiques neuromodulateur (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. Sparks et Cooper, 2004; Sparks et al, 2004;. Thabor et Cooper , 2002;) qui influencent les piscines des vésicules synaptiques et cinétique (Logsdon et al, 2005;. Southard et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) a également été examinée, qui ouvre la voie à de nouvelles questions à aborder. Les concepts du rôle du calcium par rapport au cours de STF dépolarisation de la membrane dans la transmission synaptique à la JNM ouvre conduire à des divergences d'opinion (Mulkey et Zucker, 1991; Hochner et al, 1989).

    Relativement récente, la différenciation régionale de la force synaptique et la facilitation de la simple neurone moteur, a été abordée et semble être due à des différences d'évolution locale présynaptique dans la structure et la physiologie synaptique (Atwood et al, 1994;. Atwood et Cooper, 1995, 1996a , b; Cooper et al, 1995b, 1996a, b).. Analyse ultrastructurale du électrons des études micrographiques ont montré que les varicosités contiennent la majorité des contacts synaptiques (Florey et Cahill, 1982;. Cooper et al, 1995b). La force de la transmission synaptique diminue le long de la longueur d'un seul terminal qui semble être dû à la complexité de la structure synaptique (Cooper et al, 1996a;.. Govind et al, 1994). Les différences dans la structure synaptique peut expliquer en partie les différences dans les influx de Ca2 + lors de la stimulation à diverses fréquences (Cooper et al., 1995b, 1996b).

    Comme il ya des différences régionales dans le phénotype de muscle et de la biochimie parmi les fibres musculaires de l'ouvreur (g · nzel, et al, 1993;.. Mykles et al, 2002) qui sont divisés en régions, pourrait expliquer un phénotype musculaire régulés par le développement que les influences et maintient les différences régionales du neurone moteur (Mykles et al., 2002). L'idée d'influences rétrogrades a été étudiée dans le muscle squelettique de grenouille (Nudell et Grinnell, 1983), dans le homard (Katz et coll., 1993), et les écrevisses (Lnenicka et Mellon, 1983) avec des preuves convaincantes raisonnable. La réglementation locale de terminaux dans un seul neurone, sans influencer les autres terminaux est spatialement tout à fait possible dans les neurones moteurs crustacés car les terminaux peuvent mesurer de 1cm à 10cm de distance les uns des autres. Contrairement vertébrés, une unité de moteur peut inclure plus d'un muscle dans les invertébrés (voir revue par Atwood, 1973). Le neurone excitateur moteur qui innerve le muscle ouvre toute innerve aussi le muscle civière dans un segment de la jambe plus proximal. Mesures de facilitation entre les fibres musculaires du muscle ouvreur a montré qu'il existe des différences qui peuvent être liées à des niveaux de repos dans ions Ca2 + (Cooper et al., 2005b) et / ou éventuellement en collaboration de la libération (Parnas et coll., 1982a, b)

    Les différences dans la complexité structurelle des synapses haute et basse-sortie ainsi que les bornes sur le muscle ouvreur ont été étudiés pour les signatures quantique en matière de recrutement d'actiavez des zones parmi les synapses durant STF, mais cela s'est avéré être difficile à déterminer (Lancaster et al, 2007;. Viele et al, 2003, 2006.). Possible les piscines de vésicules parmi les synapses haute et basse-sortie se révélera être réglementés de manière différentielle dans les cinétiques comme il est connu neromodulators ont des effets différenciés sur les terminaux bas et à haut rendement (Logsdon et al, 2005;. Sparks et Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

    L'utilisation future de la préparation musculaire en ouvre d'écrevisses est aussi riche comme il l'a été de 50 ou 100 ans. La préparation est encore très vivace en comparaison à beaucoup d'autres préparations synaptique. Réponses quantiques peuvent être enregistrées directement électrophysiologiques au niveau des contacts synaptiques ainsi que imagés pour la dynamique des vésicules dans les différents types de terminaux bien défini. La préparation n'a pas perdu de son charme d'avoir seule neurones identifiables pour les entrées excitatrices et inhibitrices. Malgré les écrevisses ne pas être pratique pour les manipulations génétiques, les études sont possibles pour aborder le rôle des protéines synaptiques comme pour la drosophile. Il ya de nombreuses similitudes dans la fonction synaptique au drosophile NMJs (Atwood et Cooper, 1995, 1996a, b) qui peuvent être examinés par des études d'injection de protéines (He et al., 1999). La réglementation des piscines dans les vésicules synaptiques des terminaisons nerveuses du moteur est aussi une région riche d'une enquête à venir ainsi que des études mécanistiques pour comprendre la régulation du calcium au cours de STF (Desai et Shah et al, 2008;. Desai et Shah et Cooper, 2009) pour expliquer de nombreux des mystères qui restent dans les bases de la transmission synaptique.

    Méthodes

    Dissection

    Ecrevisses, Procambarus clarkii, mesurant 6-10 cm de longueur du corps (Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA) sont amenés à automatiser la première étape ou la deuxième marche par force pincement au niveau du segment ischiopodite.

    Figure 1
    Tourner la jambe autour jusqu'à ce que l'on peut être sûr à l'extérieur (côté latéral) est orientée vers le haut sur la plaque de dissection. C'est généralement le côté voûté au-dessus. Placer la jambe sur un morceau de papier de soie contribue ainsi à la préparation peut être tourné facilement, tout en faisant ces coupures.

    Figure 2

    Avec un disjoncteur lame de scalpel et porte une lame de rasoir est utilisé pour graver la cuticule jusqu'au simplement couper à travers dans le motif représenté dans cette figure pour le segment meropodite. Les soins doivent être utilisés de ne pas couper trop loin sur la dorsale distale de couper ventrale par le meropodite - joint carpopodite. Laisser la cuticule en place pour l'instant.

    Figure 3

    Figure 4

    Avec la lame de rasoir scalpel etch la cuticule sur le propodite jusqu'à ce que la coupe grâce au modèle montré dans la figure ci-dessus pour le segment propodite d'un côté et répétez de l'autre côté de rejoindre les coupes proximales. Les soins doivent être utilisés de ne pas couper dans le muscle ouvreur. Cela peut être fait en gardant la lame penche vers la plus proche du muscle lors de la coupe à travers la cuticule. Aussi pour la dorsale de couper ventrale, reliant autour de la face ventrale, veillez à ne pas couper trop proximale que la connexion commune est étroit et se brisent facilement. Laisser la cuticule en place pour l'instant.

    Figure 5

    Les préparatifs doivent être mis en solution saline. Ce plat doit avoir une dissection Sylgard (Dow Corning) revêtement sur le fond (1cm d'épaisseur). Le Sylgard est utilisée afin que les broches d'insectes peut être coincé dedans pour la tenue de la préparation encore. A ce point planter une épingle dans le coin dorsale caudale, dans la coupe, de la fenêtre de rendu dans le meropodite.
    Avec de fines pinces (# 5) soulever légèrement la cuticule de l'extrémité distale et avec le rasoir, couper les fibres du muscle fléchisseur loin de la cuticule, coupe dans une manière distale à proximale. Soulevez la fenêtre d'arrêt cuticule.

    Figure 6

    Figure 7

    Maintenant, coupez l'apodeme (tendon) au meropodite - carpopodite commune (ci-dessous). Soyez très prudent pour tirer le tendon loin de la cavité jambe avant de prendre la coupe et à seulement coupé le tendon et non le nerf principal qui est la jambe sur le côté interne du tendon. Pincez le tendon où il a été coupé avec une pince à épiler et tirez le muscle fléchisseur off en le soulevant dans une direction caudale. Maintenant, le nerf principal et la jambe du muscle extenseur sont exposés.

    Figure 8

    Procéder au segment propodite et maintenant coupé à la dactylop propoditeodite commune. Voici la plus proche du tendon peut être coupé de l'attachement cuticule. Tirez sur la ventrale (côté proche du muscle) segment du propodite bas et en arrière caudalement, de sorte que le muscle fixé dans la région caudale peut être vu. Coupez ces muscles avec le rasoir. Attention à ne pas couper le muscle trop près de l'articulation et le risque de couper la branche du nerf moteur du muscle ouvreur. Le muscle ouvreur est maintenant exposée à la solution saline.

    Figure 9

    Figure 10

    Retour à la région meropodite pour isoler les faisceaux nerveux contenant les neurones moteurs excitateurs et inhibiteurs sur le muscle ouvreur. Dans la région la plus caudale du segment meropodite le faisceau nerveux jambe contient généralement un faisceau nerveux séparés. Cette région courts où deux faisceaux peut être vu est l'endroit où le faisceau peut être sectionné dorsale avec des ciseaux fins. L'extrémité coupée peut alors être ramassé avec des pincettes et # 5 doucement tiré distal jusqu'à environ la moitié de la longueur du segment meropodite est atteint. Cette branche du nerf long contient le nerf ouvre excitateurs et le plus grand paquet de nerfs contient les motoneurones inhibiteurs du muscle ouvreur.

    Figure 11

    Figure 12

    Figure 13

    La préparation dans le segment des coupés meropodite est maintenant de façon diagonale telle que d'une broche d'insectes peuvent être placés par la face dorsale de l'meropodite. Cette position de la face ventrale du muscle ouvreur place pour qu'elle soit face à l'observateur (comme indiqué ci-dessous).

    Figure 14

    Figure 15

    Figure 16

    Les fibres résiduelles de la plus proche du muscle qui bloque la vue sur le muscle ouvreur peut maintenant être retiré en poussant les fibres contre la cuticule et hors de la cavité propodite. Parfois, un tissu conjonctif couvre l'ouvreur qui peut être enlevé par précaution à l'aide du n ° 5 des pincettes. Le nerf jambe principale qui longe le muscle ouvre et va dans le dactylopodite peut être coupé dans le début de l'articulation dactylopodite ou tout simplement tiré vers le haut avec la pince fine. Ce nerf jambe principale et parfois le vaisseau sanguin évidents associés peuvent maintenant être tiré doucement dans une direction proximale pour la longueur du muscle ouvre puis couper.

    Figure 18

    Maintenant ouvre le muscle est exposé sans tissu pour obtenir de la manière d'une électrode intracellulaire ou une électrode macropatch focale.

    Figure 19

    Afin de stimuler le nerf au muscle excitateurs ouvre la préparation est maintenant déménagé à une chambre d'enregistrement conçu avec une électrode d'aspiration en plastique. Ayant intégré l'électrode de stimulation dans la chambre évite d'avoir à utiliser un micromanipulateur de placer une électrode de stimulation. Pin de la préparation dans le plat d'enregistrement et de placer la branche du nerf qui contient le nerf excitateur dans l'électrode de succion.

    Figure 20

    Figure 21

    (Tiré de: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., et Cooper, RL (2002) de protéines myofibrillaires isoforme expression est corrélée avec l'efficacité synaptique dans les fibres lentes de la griffe et les muscles ouvre la jambe de l'écrevisse et le homard Journal of. Experimental Biology 205 (4): 513-522).

    Saline

    Des préparations disséquées sont maintenus dans des écrevisses saline, solution d'un Van Harreveld modifiés (en mM: NaCl 205; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O; HEPES 5 ajusté à pH 7,4).

    Enregistrement intracellulaire PPSE

    Pour obtenir une réponse évoquée, l'axone excitateurs est sélectivement stimulée par un stimulateur Grass. Une région de muscle ouvreur est empalé avec électrode intracellulaire forte (20 à 30 de résistance mOhm) remplie avec 3 M de KCl. Une étape tête standard et d'un amplificateur pour l'enregistrement intracellulaire peut être utilisé, mais nous avons utilisé un modèle Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) amplificateur et une tête de stade X LU. La facilitation à court terme (STF) ou divers autres types de réponses souhaitées peuvent être obtenues en faisant varier les conditions de relance. STF est obtenu en donnant un train de 10 ou 20 impulsions à 10 ou 20 secondes d'intervalle, respectivement, au nerf excitateur. La fréquence de stimulation dans le train peut être variée (40, 60 et 80 Hz). Intrenregistrements EPSP acellulaire sont régulièrement effectuées par ces procédures standard (Crider & Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al, 1995b; Dudel, 1983; Sparks et Cooper, 2004; Desai et Shah et Cooper, 2009).

    Le muscle ouvreur est divisé en trois régions générale: distale, centrale et proximale. Même si l'ensemble du muscle ouverte est innervée par un seul neurone moteur, le NMJs sont structurellement différents et ont des différences régionales spécifiques dans l'efficacité synaptique dans ces trois régions en général (Cooper et al. 1995a, b). Le type de phénotype des fibres musculaires a également été montré pour être différent dans ces régions (Mykles et al. 2002). Pour ces raisons, les fibres les plus distales sont utilisés, car ils sont facilement délimitée pour la cohérence entre les préparations.

    Figure 22

    Enregistrement focale RPEB quantique directement sur les régions identifiables de la terminaison nerveuse

    Les varicosités synaptiques sont visualisés avec le colorant vital 4-di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), qui n'affecte pas la transmission synaptique, aux concentrations et les temps employés (5 uM, 5 min de traitement, Cooper et al ., 1995b). Avec la microscopie à fluorescence, la lumière d'une électrode d'enregistrement de macro-patch (Cooper et al, 1995c;.. St ¨ hmer et al, 1983) pourrait être placé directement sur ​​une varicosités isolé. Pour évoquer la terminaison nerveuse, le nerf moteur excitateur est stimulé comme mentionné ci-dessus. Spontanées ainsi que les réponses évoquées quantiques peuvent être enregistrées le long de la chaîne de varicosités visualisées, par un léger abaissement de la lumière et de l'élever sur chaque varicosités.

    Les potentiels synaptiques sont enregistrés grâce à une électrode de macro-patch essentiellement comme décrit par Dudel, 1981; Wojtowicz et al. (1991) et Mallart (1993). Kimax verre (diamètre extérieur: 1,5 mm) a été tiré et polie au feu pour produire des conseils de patch avec des diamètres intérieurs allant de 10 à 20 um. La lumière de l'électrode est remplie avec le milieu de bain. L'amplificateur est le même que celui utilisé pour les enregistrements intracellulaires mentionnés ci-dessus. Électrodes et la résistance d'étanchéité peut être déterminé par le passage des impulsions de test courant à travers l'électrode. Sceau résistances ont varié de 0,3 à 1,0 M0hm et la résistance d'électrode variait de 0,5 à 1,0 M.0. Résistance Seal peut être surveillé tout au long de l'enregistrement.

    Comptage direct des événements quantiques est possible avec des fréquences de stimulation faible. Pour chaque réponse évoquée, le nombre d'événements quantiques peuvent être déterminées. Pour une série de réponses, le nombre total d'événements quantiques sont comptés pour ensuite estimer la teneur moyenne quantique fondée sur ces dénombrements directs. Une approche pour calculer la teneur moyenne quantique est de prendre le nombre total de quanta et diviser par le nombre total de réponses (del Castillo et Katz, 1954). Il ya d'autres approches, on peut utiliser aussi bien basés sur l'amplitude du pic ou de la zone de l'EPSP (Cooper et al., 1995b).

    Disclosures

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