Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

Comentarios generales sobre clasificación magnética de bolas de Drosophila neuronas periféricas (El tiempo total para la conclusión del Protocolo: 2.5-3 horas)

Procedimientos estándar de laboratorio para el mantenimiento de un medio ambiente limpio, libre de ARNasa deben ser observadas en todo momento para evitar la degradación del ARN.

Cuando la cutícula larval de Drosophila se diseca y se coloca en el buffer de disociación celular, las neuronas periféricas son una de las celdas última a desprenderse de la cutícula. Hemos explotado esta propiedad y diseñado este protocolo para eliminar la mayoría de las células no específicas de la cutícula, como el músculo y la grasa antes de aislar las neuronas da.

Con la práctica, todo el protocolo puede ser completado con éxito dentro de aproximadamente 2,5 horas. La preparación de cuentas recubiertas de anticuerpos debe ser completado antes de que el experimento comienza.

1. La preparación de partículas magnéticas de las células Encuadernación:

Este paso debe ser completado antes del inicio del experimento. Las cuentas preparadas pueden ser preparadas y almacenadas a 4 º C hasta que se necesite.

1. Lavado de 100 l de Dynabeads M-280 bolas recubiertas de estreptavidina tres veces en PBS por resuspensión en 500 l de PBS y granulación en un campo magnético fuerte cada vez.
2. Finalmente volver a suspender las cuentas directamente en 100 l de puro rata con biotina de anticuerpos anti-ratón-CD8a (concentración de anticuerpos es de 100 ug / ml).
3. Incubar la mezcla durante 1 hora en hielo con agitación ocasional leve para evitar la sedimentación. [1 l de Dynabeads M-280 se puede obligar a 0,05-0,10 mg de anticuerpos con biotina].
4. Lave la mezcla de grano de anticuerpos tres veces como se describe en el paso 1.1 para eliminar el exceso de anticuerpos. Las bolas magnéticas están recubiertas con anticuerpos y listo para ser utilizado. Guarde la mezcla de bolas de anticuerpos en 100 l de PBS 1X a 4 º C hasta su uso.

2. Selección y lavado de larvas: (10-15 minutos)

1. Elige misma edad 30-50 larvas de tercer estadio y colocarlos en un tubo de microcentrífuga con 1,6 ml de fosfato de 1 a 1,2 ml 1X solución salina (PBS). (3-5 minutos)
2. Cerrar el tubo y agitar en el que el valor máximo tres veces durante 1 segundo cada uno.
3. El uso de un pulido al fuego pipeta Pasteur de descartar el sobrenadante por completo. Repita el lavado (2.1) y agitar (2,2) los pasos 3-4 veces hasta que el sobrenadante es visiblemente libres de cualquier partícula de alimentos y residuos.
4. Brevemente repetir el lavado con 1 ml de etanol al 70% y descartar el sobrenadante.
5. Lave las larvas dos veces con 1 ml de H 2 Odd y descartar el sobrenadante.
6. Brevemente repetir el lavado de nuevo con 1 ml de RNasa-AWAY y descartar el sobrenadante.
7. Lavado de las larvas de tres veces en 1 ml de ddH2O para asegurar la eliminación completa de la RNasa-AWAY.

3. Disección: (10-12 minutos)

1. Coloque 10-12 larvas en el centro de una placa de 35 mm recubierto Sylgard Petri. Posición a un poco de distancia el uno del otro. [Paso Crítico: Desechar cualquier larva que no parecen estar en la etapa de desarrollo apropiada]
2. Corte el extremo anterior de las larvas con un par de tijeras de disección fina de todas las larvas.
3. Con un par de aburridos Dumont N º 5 pinzas de invertir las larvas de dentro a fuera. Insertar una pinza en el interior de la cutícula larval todo el camino hasta el extremo posterior. Apriete la punta de la pinza en conjunto para agarrar el extremo posterior de la cutícula (Figura 1a) (prueba a pulsar la cutícula hacia abajo en la superficie Sylgard para hacer más fácil). Usando el segundo par de pinzas, empuje la cutícula larval de adentro hacia afuera. [Paso Crítico: Trate de practicar este método un par de veces antes de intentar el experimento de aislamiento de células. Trate de obtener las larvas completamente invertido, para asegurarse de que todos los tejidos blandos están expuestos a la solución para facilitar la disociación.]
4. Después de la disección de las larvas de 3-4, trasladarlos de inmediato a frescas, helado de PBS (se coloca el tubo en hielo) en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml.
5. Repita los pasos 3,1 a 3,4 hasta que todas las larvas requieren son recogidos (larvas de 30-40 en este protocolo). [Paso Crítico:. Anticipar 10-20% de pérdida durante la disección y la disociación, y planificar en consecuencia]

4. La eliminación de baja adherencia no específica las células: (2-3 minutos)

[Este paso ayuda a la limpieza de baja adherencia no tejidos específicos, tales como cuerpos grasos y el SNC.]

1. Tome el tubo de 1,6 ml de microcentrífuga que contiene la cutícula larval invertida y sustituir el sobrenadante con aproximadamente 700 a 800 l de agua dulce helado de PBS.
2. Pulse-vórtice del tubo de microcentrífuga 5 veces (3 segundos por pulso) a toda velocidad.
3. Descartar el sobrenadante y reemplazarlo con aproximadamente 700-800 l fresco, helado de PBS.
4. Repita los pasos 4,2 y 4,3 veces tres.
5. Resuspend la cutícula larval en 400 l de agua dulce, helado de PBS

5. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales: (18-20 minutos)

[Paso Crítico: Más de disociación puede causar la pérdida del marcador de superficie celular que conduce a producir células pobres y la viabilidad celular baja. El tejido de las larvas se pueden disociar, ya sea mecánica disociación (ultrasonidos, douncing), la disociación enzimática (tripsina, colagenasa, etc) o una combinación de ambos. A medida que estos tejidos larvarios son difíciles de disociar, se encontró que una combinación de mecánica y enzimática disociación dado los mejores resultados.]

1. Añadir 1,5 l de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 W nsch unidades / vial) a la cutícula larval suspendieron en 400 l de PBS.
2. Vortex la solución 2-3 veces durante 1 segundo cada uno en posición máxima (Esto debería eliminar las células de baja adherencia de la cutícula en la solución).
3. Incubar la solución a temperatura ambiente (22-25 ° C) durante 5 minutos. [Paso crítico: el tiempo de incubación afecta en gran medida la eficiencia de las células de clasificación final. El tiempo de incubación recomendado debería ser suficiente para aflojar el tejido. No exceda de 15 minutos.]
4. Pulse-vórtice del tubo de 20-30 veces en la configuración máxima de 2 segundos por pulso a toda velocidad. Esto debería libera el tejido muscular y otros en la solución. Inspeccionar una pequeña muestra de la solución bajo un microscopio de fluorescencia estéreo en cada paso. (Con la experiencia de uno debe ser capaz de determinar el grado de disociación al observar el tubo de microcentrífuga directamente bajo una fluorescencia permitió estéreo-microscopio)
5. Lave la cutícula larval 2-3 veces con agua dulce, helado de PBS y finalmente se resuspenden en 500 l de BSA frescas, helado de PBS con 1%.
6. Para evitar la cutícula larval se pegue a la superficie de cristal del triturador de tejidos 2 ml Kontes y mano gran distancia, antes de cubrir el triturador de tejidos y mortero con una BSA al 1% en solución de PBS y después de un breve enjuague descartar la solución de BSA. Posteriormente, utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de las cutículas del paso 5.5 al triturador de tejidos recubiertos con BSA. [Paso Crítico: Pre-enfriar el triturador de tejidos / mortero, colocándolo en hielo durante unos minutos para prevenir el daño celular / lisis].
7. Dounce el tejido con movimientos lentos y firmes, para evitar formación de espuma (aproximadamente 20 a 30 golpes). [Paso Crítico:. Dounce lenta y constante, de lo contrario, las células pueden lisar]
8. Para evaluar los niveles de células disociación, limpie la pared exterior del triturador de tejidos con un pañuelo limpio Kimwipe, e inspeccionar debajo de un fluorescente estereomicroscopio. Las neuronas que se han desprendido de la cutícula, y se puede ver en la solución. Si esto resulta ser difícil, en su defecto pipeta una pequeña muestra de la solución, y observarlo bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Un buen indicador de disociación celular es la ausencia de las neuronas de la cutícula larval. Sin embargo, si uno sigue observando las neuronas unido a la cutícula, u observa las células incompletamente disociado, Dounce más hasta que las células lograr una suspensión de células individuales.
9. Triturar la solución 5 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 50% del diámetro de la punta estándar, seguido de 10 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 25% del diámetro de la punta estándar. [Paso Crítico: trituración enérgica puede dañar las células. Monitor de las células entre los pasos, y ajustar el procedimiento de acuerdo].
10. Filtrar la solución a través de un filtro de 30 micras de células y recoger el celular filtrado en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. La solución resultante debe consistir en una suspensión de células individuales y ya está listo para la clasificación de células magnéticas.

6. Clasificación magnética celular bolas: (45 - 75 minutos, depende del tiempo de incubación de anticuerpos)

1. Añadir 15 l de anticuerpos magnéticas recubiertas con 500 l de suspensión celular (paso 5,10). El resto de anticuerpos magnética cuentas conjugado puede ser almacenado hasta que sea necesario para aislamientos celulares siguientes.
2. Se incuban las células con anticuerpos magnéticas recubiertas por 30-60 minutos en hielo con ocasionales mezcla manual. [Paso Crítico: La incubación a una temperatura más alta o más tiempo puede dar lugar a la unión de anticuerpos no específicos.]
3. Coloque el tubo de microcentrífuga en un fuerte campo magnético durante 2 minutos. Todas las células seleccionadas positivamente con cuentas no consolidadas se separará a un lado del tubo.
4. Poco a poco pipeta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular.
5. Lavar las células 3-4 veces en agua dulce, helado de PBS para eliminar cualquier resto de células no específicas.
6. Resuspender las células en 30 l de agua dulce, helado de PBS.
7. Para aproximar la pureza y el rendimiento de las células, pipeta de 5 l de la susp celularension sobre la superficie pulida de un hemocitómetro y contar todas las células fluorescentes visibles bajo el microscopio estereoscópico fluorescente. También puedes ver la cantidad de células no fluorescentes y cualquier signo de impurezas. Normalmente, la muestra será altamente enriquecido para fabricar células fluorescentes.

7. Aislamiento del ARN de las células de bolas magnéticas Ordenado: (60 - 75 minutos)

1. Después de contar, que sedimenten las células en un campo magnético, descartar el sobrenadante y añadir 20 l de tampón de extracción de la PicoPure ™ de aislamiento de ARN Kit (Molecular Devices). Dependiendo del número de células que se pueden necesitar para añadir un mayor volumen de tampón de extracción.
2. Vórtice del tubo a la máxima velocidad para permitir la mezcla de pellet de células con tampón de extracción.
3. Incubar el tubo a 42 ° C durante 30 minutos.
4. Para asegurar la eliminación de las partículas magnéticas antes de la purificación de columna de la ARN (véase el paso 7.5), el tubo se centrifuga brevemente a 2.000 (x) g durante 2 minutos para que sedimenten las partículas magnéticas. El tubo se coloca en un campo magnético fuerte para retener el sedimento y el sobrenadante se transfiere a un tubo de microcentrífuga nuevo.
5. Extraer y purificar la columna ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante PicoPure extracción de RNA kit. DNasa tratamiento es opcional, y se puede realizar en la columna durante la purificación de ARN de acuerdo con el requisito de análisis. Por último, eluir el ARN unido total en un volumen pequeño (11-30 l) de tampón de elución y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. Si se desea una alícuota de 1 l se puede utilizar para evaluar la calidad total de ARN en un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Los resultados representativos:

Clasificación de esferas magnéticas se utilizó para aislar las neuronas da Drosophila (Figura 1). El ARN purificado a partir de estas neuronas aisladas da (Figura 2a) se encontró que era de excelente calidad, como se indica por la presencia de fuerte 5.8S, 18S y 28S del RNA ribosomal picos cuando se analiza en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partir de las larvas de tercer estadio 30-40 que éramos capaces de aislar a un promedio de 300-500 IV clase neuronas da con el controlador de PPK-GAL4 y 1500-2000 neuronas da (Clase I, II, III y IV) con la pan- da específica de neuronas GAL4 ^21-7 conductor. Para evaluar el enriquecimiento neuronal específica de las células aisladas se realizó cuantitativos transcripción reversa PCR (QRT-PCR) utilizando dos genes específicos de marcadores neuronales (elav y futsch). Estos análisis revelaron un importante enriquecimiento veces de genes marcadores que indican tanto un enriquecimiento muy específico para las neuronas da en comparación con el flujo mediante el uso de nuestro protocolo (Figura 3). Finalmente, el ARN aislado de los pan-da neuronas y de clase IV neuronas da se utilizó para realizar perfiles de expresión transcripcional de Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma de microarrays oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estos análisis identificó numerosos reguladores anteriormente implicados de la morfogénesis da neurona dendrita, además de un amplio espectro de moléculas previamente caracterizados y de supuestas vías de transducción de señal que potencialmente desempeñan importantes funciones en el desarrollo da la neurona. Estudios diseñados para evaluar el papel potencial (s) de estas moléculas no caracterizado previamente en la mediación da el desarrollo de las neuronas, las dendritas y morfogénesis en concreto, están actualmente en curso.

Figura 1:. Esquema de clasificación de bolas magnéticas de Drosophila neuronas da (a) emparejados por edad larvas de tercer estadio que lleva el da neuronal específica GAL4, UAS-mCD8-GFP reportero transgén son disecados mediante la inversión de la cutícula larval de adentro hacia fuera, para exponer la PNS a la disociación de amortiguación y almacenarse en helado de PBS. (b) la disociación enzimática se lleva a cabo mediante la adición de Liberase Blendzyme 3 a la solución que contiene la cutícula larval. (c) Los tejidos de las larvas son más disociado por una combinación de agitación, trituración y douncing para eliminar de forma no específica tejidos etiquetados como grasa cuerpos, intestino y sistema nervioso central. (d, e), las células se filtra utilizando un filtro de 30 micras de células. La solución contiene una única suspensión de células de diferentes tipos de células incluyendo epitelio, músculo y las neuronas. (F) Anti-ratón-CD8a recubiertas de anticuerpos Dynabeads M-280 se añaden a la suspensión celular, y se incubaron en hielo durante 30-60 minutos. ( g) Las partículas magnéticas se une a las neuronas que se da a un ratón que expresan CD8 etiquetado proteína GFP de fusión. (h, i) La bola recubierta de células magnético se separan mediante la colocación de la solución en un fuerte campo magnético. Se desecha el sobrenadante y las células se lavan tres veces para eliminar cualquier residuo no específicos de las células, dando lugar a (j) highly poblaciones purificadas de neuronas DA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 1.

Figura 2: (a) representante de la imagen positiva seleccionados, GFP fluorescentes de clase IV neuronas da aisladas por disociación celular y la clasificación de cuentas magnéticas. La población resultante de las neuronas se determinó que era altamente enriquecido para la clase IV neuronas da con poca o ninguna célula impurezas contaminantes. (B) Un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) electroferograma de ARN total aislado de perlas magnéticas ordenados neuronas DA , mostrando una excelente calidad de ARN total como se indica por la presencia de 5.8S, 18S, 28S y ARNr. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

Figura 3: QRT-PCR análisis de la expresión del gen marcador neuronal en neuronas aisladas da (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) y el flujo a través de la fracción se realizó por triplicado. Los niveles de expresión de los dos genes marcadores neuronales específicos (elav y futsch) fueron evaluados por QRT-PCR. Los valores obtenidos de estos análisis se normalizaron con el control endógeno (rp49), y los niveles relativos a los observados en el flujo a través de la fracción se calcula utilizando el método ΔΔCτ ^6. Ambos elav y futsch se enriquecieron de manera significativa en la aislada población de neuronas da en comparación con el flujo a través de la fracción.

Figura 4: Representante de la Clase IV-da neuronal específica Cy3 etiquetado de archivos de imagen de microarrays. Aquí se muestra un Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma-oligo microarrays (4 x 44K) hibridado con Cy3-labeld ARN total aislado de la clase IV neuronas da purificado por la clasificación de cuentas magnéticas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 4.

El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas de las etapas de desarrollo (por ejemplo, el epitelio, músculo, otras neuronas periféricas) pueden ser adaptados por variando algunos parámetros y el uso de distintas GAL4, UAS-mCD8-GFP transgenes reportero que la etiqueta del tipo de célula o los tipos de interés. Además, este protocolo puede ser utilizado tanto en la pérdida de la función y los enfoques de ganancia de función en la que puede ser un gen de interés clonado en un transgén UAS-GFP-mCD8 que puede ir acompañado de un transgén GAL4 para dirigir cualquiera de los genes- específicos de pérdida de función (por ejemplo, UAS-RNAi) o ganancia de función a un tipo de célula de interés. Por ejemplo, en el caso de un factor de transcripción que se quiera identificar genes potencialmente arriba o hacia abajo-regulado en la pérdida de la función o el aumento de la función de expresión en un tipo de célula de interés. Al aislar el ARN total a partir del tipo de células purificadas de interés a través de este protocolo y el uso de este ARN para realizar perfiles de expresión de microarrays es posible identificar los genes regulados diferencialmente que pueden representar los objetivos intermedios de regulación de la transcripción que juegan un papel en la mediación de los cambios fenotípicos dentro de la célula .

Para la selección de células éxito es esencial para dar atención a los pasos críticos destacados en el protocolo anterior. Ejemplos de áreas de problemas comunes que pueden requerir algunos ajustes y optimización, dependiendo del tipo de célula, incluyen (1) producción de células de baja y (2) formación de grumos de células durante el aislamiento de cuentas magnéticas. En el primer caso, se puede tratar de reducir la concentración de Liberase Blendzyme 3, y compensar mediante el aumento de disociación mecánica a través de douncing. En el segundo caso, uno puede intentar reducir la intensidad del campo magnético mediante la aplicación de una capa única o múltiple de cinta adhesiva de laboratorio sobre el imán.