Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

Commenti generali su Magnetic Ordinamento Bead della Drosophila neuroni periferici (Timing totale per il completamento del protocollo: 2,5-3 ore)

Procedure standard di laboratorio per il mantenimento di un ambiente pulito e libero RNAse devono essere osservate in ogni momento per evitare la degradazione dell'RNA.

Quando la cuticola larvale Drosophila viene sezionato e posto nel buffer di dissociazione delle cellule, i neuroni periferici sono una delle celle ultima a staccarsi dalla cuticola. Abbiamo sfruttato questa proprietà e progettato questo protocollo per rimuovere la maggior parte dei non-specifico le cellule dalla cuticola come il muscolo e grasso prima di isolare i neuroni da.

Con la pratica, il protocollo intero può essere completato con successo nel giro di circa 2,5 ore. La preparazione di perline legate agli anticorpi devono essere completate prima che l'esperimento comincia.

1. Preparazione Perline magnetica per celle Rilegatura:

Questo passaggio deve essere completato prima dell'inizio dell'esperimento. Le perle preparato possono essere preparati e conservati a 4 ° C fino al momento.

1. Lavare 100 ml di Dynabeads M-280 beads Streptavidin ricoperto per tre volte in PBS da resuspending in 500 ml di PBS fresco e cubettatura è in un forte campo magnetico ogni volta.
2. Infine risospendere le sfere direttamente in 100 ml di anticorpi di ratto non diluito biotinilato anti-topo-CD8a (concentrazione di anticorpi è 100 mg / ml).
3. Incubare la miscela per 1 ora su ghiaccio con occasionali vortex da lieve a evitare la sedimentazione. [1 ml di Dynabeads M-280 può legare 0,05-0,10 mg di anticorpo biotinilato].
4. Lavare il tallone-anticorpo miscela tre volte come descritto al punto 1.1 per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Le sfere magnetiche sono rivestiti con anticorpo e pronto per essere utilizzato. Conservare il cordone-anticorpo miscela in 100 ml di PBS 1X a 4 ° C fino all'utilizzo.

2. Selezione e lavaggio Larve: (10-15 minuti)

1. Scegli stessa età 30-50 larve terzo instar e metterli in una provetta per microcentrifuga 1.6ml con 1-1,2 ml di 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 minuti)
2. Tappare la provetta e vortice che al valore massimo tre volte per 1 secondo ciascuna.
3. Utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur scartare il surnatante completamente. Ripetere il lavaggio (2,1) e vortex (2,2) passi 3-4 volte fino a quando il surnatante è visibilmente chiaro di particelle di cibo e detriti.
4. Brevemente ripetere il lavaggio con 1 ml di etanolo al 70% e scartare il surnatante.
5. Lavare le larve due volte con 1 ml di ddH2O e scartare il surnatante.
6. Brevemente ripetere il lavaggio, ancora una volta con 1 ml di RNAsi-AWAY e scartare il surnatante.
7. Lavare le larve tre volte in 1 ml di ddH2O per assicurare la rimozione completa di RNAsi-AWAY.

3. Dissezione: (10-12 minuti)

1. Luogo 10-12 larve al centro di un piatto rivestito Sylgard 35 millimetri Petri. Posizione leggermente distanza gli uni dagli altri. [Punto Critico: Eliminare qualsiasi larve che non sembrano essere al momento opportuno di sviluppo]
2. Taglio aperto la punta anteriore delle larve con un paio di forbici dissezione bene per tutte le larve.
3. Utilizzando un paio di sordo Dumont n ° 5 pinze invertire le larve dentro-fuori. Inserire una pinza all'interno della cuticola larvale fino alla fine posteriore. Pizzicare la punta delle pinze insieme per afferrare l'estremità posteriore della cuticola (Figura 1a) (provate a premere la cuticola sulla superficie Sylgard per rendere più facile). Utilizzando la seconda coppia di pinze, spingere le cuticole larvali dentro e fuori. [Punto Critico: Prova pratica di questo metodo un paio di volte prima di tentare l'esperimento di isolamento delle cellule. Cercare di ottenere le larve completamente invertito, per garantire che tutti i tessuti molli sono esposti a una soluzione per una facile dissociazione.]
4. Dopo la dissezione larve 3-4, trasferirli immediatamente a fresco, ghiacciato PBS (posizionare il tubo in ghiaccio) in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml.
5. Ripetere i passaggi 3,1-3,4 fino a che tutte le larve richiesti sono raccolti (30-40 larve in questo protocollo). [Fase critica:. Anticipare la perdita di 10-20% durante la dissezione e la dissociazione, e pianificare di conseguenza]

4. Rimozione di vagamente aderente non specifiche cellule: (2-3 minuti)

[Questa fase aiuta la compensazione di vagamente aderente non specifici tessuti come corpi grassi e del SNC.]

1. Prendere la microcentrifuga 1,6 ml tubo contenente le cuticole invertita larvale e sostituire il surnatante con circa 700-800 ml di fresca ghiacciata PBS.
2. Pulse-vortice nella provetta per microcentrifuga 5 volte (3 secondi per impulso) a piena velocità.
3. Eliminare il supernatante e sostituirlo con circa 700-800 microlitri fresca, ghiacciata PBS.
4. Ripetere i passi 4.2 e 4.3 per tre volte.
5. Resuspend le cuticole larvali in 400 ml di fresco, ghiacciato PBS

5. Dissociare il tessuto in una sospensione singola cella: (18-20 minuti)

[Punto Critico: Over-dissociazione può causare la perdita della superficie cellulare marcatore porta alla produzione di cellule poveri e vitalità cellulare basso. Il tessuto larvale può essere dissociata da una dissociazione meccanica (sonicazione, douncing), dissociazione enzimatica (tripsina, collagenasi, ecc) o una combinazione di entrambi. Poiché questi tessuti larvali sono difficile dissociare, abbiamo scoperto che una combinazione di entrambi meccanica e dissociazione enzimatica ha dato i migliori risultati.]

1. Aggiungere 1,5 ml di Liberase Blendzyme 1X 3 (28 W unità nsch / fiala) per la cuticola larvale sospesi in 400 ml di PBS.
2. Vortex la soluzione 2-3 volte per 1 secondo ciascuno al valore massimo (Questo dovrebbe rimuovere le cellule aderenti liberamente dalla cuticola nella soluzione).
3. Incubare la soluzione a temperatura ambiente (22-25 ° C) per 5 minuti. [Punto Critico: I tempi di incubazione influenza notevolmente l'efficienza finale separazione delle cellule. Il tempo di incubazione raccomandato dovrebbe essere sufficiente per allentare il tessuto. Non superare i 15 minuti.]
4. Pulse-vortice del tubo 20-30 volte con impostazioni al massimo per 2 secondi per impulso a tutta velocità. Questo dovrebbe rilascia i muscoli e altri tessuti nella soluzione. Ispezionare un piccolo campione dalla soluzione sotto un fluorescente stereo-microscopio ad ogni passo. (Con l'esperienza si dovrebbe essere in grado di determinare il livello di dissociazione osservando la provetta da microcentrifuga direttamente sotto una fluorescenza abilitato stereomicroscopio)
5. Lavare le cuticole larvali 2-3 volte fresca, ghiacciata PBS e infine li risospendere in 500 ml di fresca, ghiacciata BSA PBS contenente 1%.
6. Per evitare la cuticola larvale attaccarsi alla superficie del vetro del 2 ml tessuto Kontes macina e il pestello spazio di grandi dimensioni, pre-coat la smerigliatrice tessuti e pestello con una BSA 1% in soluzione PBS e dopo un breve risciacquo scartare la soluzione di BSA. Successivamente, utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur, trasferire le cuticole dal punto 5.5 al BSA rivestite grinder tessuti. [Fase critica: Pre-raffreddare la smerigliatrice tessuto / pestello ponendolo in ghiaccio per qualche minuto per evitare danni alle cellule / lisi].
7. Dounce il tessuto con tratti lento e costante, evitando la formazione di schiuma (circa 20-30 colpi). [Punto Critico:. Dounce lentamente e costantemente, altrimenti le cellule possono lisare]
8. Per valutare i livelli di cellule dissociazione, pulire il muro esterno della smerigliatrice tessuto con un tessuto Kimwipe pulire ed esaminare sotto un fluorescente stereo-microscopio. I neuroni dovrebbe avere staccato dalla cuticola, e può essere visto nella soluzione. Se questo si trova ad essere difficile, in alternativa pipetta da un piccolo campione della soluzione, e osservare sotto un fluorescente stereo-microscopio. Una buona indicazione di cellula dissociazione è l'assenza di neuroni dalla cuticola larvale. Tuttavia, se si osserva ancora i neuroni attaccati alla cuticola, o osserva le cellule non completamente dissociato, dounce ulteriormente fino a quando le cellule ottenere una sospensione singola cellula.
9. Triturare la soluzione 5 volte con un incendio lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 50% del diametro della punta standard, seguito da 10 volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 25% del diametro della punta standard. [Punto Critico: triturazione Forceful possono danneggiare le cellule. Monitorare le cellule tra i passaggi, e regolare la procedura di conseguenza].
10. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 30 micron cellulari e raccogliere le cellule filtrato in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml. La soluzione risultante deve essere costituito da una sospensione singola cellula ed è ora pronto per l'ordinamento delle cellule magnetica.

6. Magnetici Ordinamento Bead Cell: (45 - 75 minuti, dipendente dal tempo di incubazione degli anticorpi)

1. Aggiungere 15 ml di anticorpi sfere rivestiti magnetico a 500 l di sospensione cellulare (punto 5.10). I restanti anticorpi coniugati perline magnetiche possono essere conservati fino al momento della cella di isolamento successive.
2. Incubare le cellule con anticorpi sfere rivestiti magnetico per 30-60 minuti in ghiaccio con occasionali miscelazione manuale. [Fase critica: incubazione ad una temperatura più alta o più a lungo tempo può causare legame aspecifico degli anticorpi.]
3. Collocare la provetta da microcentrifuga in un forte campo magnetico per 2 minuti. Tutte le cellule positivamente selezionato insieme con perline legato separerà al lato del tubo.
4. Lentamente pipetta il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
5. Lavare le cellule 3-4 volte in acqua dolce, ghiaccio, freddo PBS per rimuovere qualsiasi residuo non specifiche cellule.
6. Risospendere le cellule in 30 ml di fresco, ghiacciato PBS.
7. Per approssimare la purezza e la resa delle celle, pipettare 5 ml di sosp della cellulaENSIONE sulla superficie levigata di un emocitometro e contare tutte le cellule fluorescenti visibili sotto un fluorescente stereo-microscopio. Anche controllare la quantità di cellule non fluorescente e tutti i segni di impurità. In genere il campione sarà fortemente arricchito per le cellule fluorescenti.

7. Isolamento RNA da cellule magnetica Bead ordinato: (60 - 75 minuti)

1. Dopo il conteggio, agglomerare le cellule in un campo magnetico, scartare il surnatante e aggiungere 20 ml di tampone di estrazione dal â„¢ PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). A seconda del numero di cellule che si possano desiderare per aggiungere un maggiore volume di tampone di estrazione.
2. Vortex il tubo alla massima velocità per consentire la miscelazione di pellet con tampone di estrazione.
3. Incubare la provetta a 42 ° C per 30 minuti.
4. Per assicurare la rimozione degli sfere magnetiche prima colonna purificazione del RNA (vedi punto 7.5), il tubo viene brevemente centrifugata a 2.000 (x) g per 2 minuti per far sedimentare le sfere magnetiche. Il tubo viene quindi posto in un forte campo magnetico per mantenere il pellet, e il supernatante è trasferito in una provetta da microcentrifuga nuovo.
5. Estrarre e purificare l'RNA colonna secondo le istruzioni del produttore estrazione PicoPure RNA kit. DNAsi trattamento è facoltativo, e può essere eseguita su colonna durante la purificazione di RNA secondo le esigenze di analisi. Infine, eluire l'RNA totale legato in un piccolo volume (11-30 mL) di tampone di eluizione e conservare a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo. Se lo si desidera un 1 microlitri aliquota può essere utilizzato per valutare la qualità totale RNA su un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Rappresentante dei risultati:

Magnetici ordinamento cordone è stato utilizzato per isolare Drosophila da neuroni (Figura 1). L'RNA purificato da questi neuroni isolati da (Figura 2a) è risultato essere di ottima qualità, come indicato dalla presenza di forte 5.8S, 18S e 28S picchi di RNA ribosomiale se analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partire da 30-40 larve terzo instar siamo stati capaci di isolare in media 300-500 classe IV neuroni da utilizzando il PPK-GAL4 driver e 1500-2000 da neuroni (Classe I, II, III e IV) con il pan- da neurone specifico GAL4 ^21-7 driver. Per valutare l'neuronali specifici per l'arricchimento delle nostre cellule isolate abbiamo eseguito trascrizione inversa PCR quantitativa (QRT-PCR) utilizzando due neuronale gene-specifici marcatori (ELAV e futsch). Queste analisi hanno rivelato significativo arricchimento piega di entrambi i geni marker che indica un arricchimento altamente specifico per i neuroni da rispetto al fluire attraverso usando il nostro protocollo (Figura 3). Infine, l'RNA isolato da entrambi i pan-da neuroni e di classe IV da neuroni è stato utilizzato per eseguire il profiling trascrizionale dell'espressione su Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) (Figura 4). Queste analisi hanno identificato numerosi regolatori precedentemente implicato della morfogenesi da neurone dendrite oltre ad un ampio spettro di molecole in precedenza e non caratterizzato putativo vie di trasduzione del segnale che potenzialmente svolgono importanti ruoli funzionali in fase di sviluppo da neurone. Studi volti a valutare il ruolo potenziale (s) di queste molecole non caratterizzato in precedenza nella mediazione da sviluppo dei neuroni, e specificamente la morfogenesi dendriti, sono attualmente in corso.

Figura 1:. Schematica di smistamento magnetico goccia di Drosophila neuroni da (a) Età abbinati larve terzo instar porta il neurone specifico da GAL4, UAS-mCD8-GFP giornalista transgene sono sezionati invertendo la cuticola larvale inside-out, per esporre la PNS di dissociazione del buffer e conservati in ghiaccio PBS freddo. (b) dissociazione enzimatica è realizzato con l'aggiunta Liberase Blendzyme 3 per la soluzione contenente cuticola larvale. (c) I tessuti larvali sono ulteriormente dissociato da una combinazione di vortex, triturazione e douncing per rimuovere i tessuti non specificamente etichettati come grassi corpi, intestino e sistema nervoso centrale. (d, e) Le cellule sono poi filtrati con un filtro da 30 micron cellula. La soluzione contiene un'unica sospensione cellulare di diversi tipi di cellule tra cui epiteli, muscoli e neuroni. (F), anti-topo CD8a-anticorpi Dynabeads M-280 sono aggiunti alla sospensione cellulare, e incubate in ghiaccio per 30-60 minuti. ( g) Le sfere magnetiche si lega ai neuroni che esprimono da un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP. (h, i) Le cellule del cordone magnetico rivestito sono separati ponendo la soluzione in un forte campo magnetico. Il supernatante viene scartato, e le cellule vengono lavate tre volte per rimuovere eventuali residui non specifica delle cellule, con conseguente (j) highly purificato da popolazioni di neuroni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

Figura 2: (a) immagine rappresentativa del positivamente selezionato, fluorescente GFP classe IV neuroni da cellule isolate dalla dissociazione e magnetici ordinamento tallone. La popolazione risultante di neuroni è stato considerato altamente arricchito per la classe IV da neuroni con poca o nessuna impurità cellule contaminanti. (B) Un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) elettroferogramma di RNA totale isolato da perla magnetica neuroni ordinati da , mostrando un ottimo rapporto qualità RNA totale, come indicato dalla presenza di 5.8S, 18S e 28S rRNA. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Figura 3: qRT-PCR dell'espressione neuronale gene marcatore in isolate da neuroni (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) e il flusso attraverso la frazione è stata eseguita in triplice copia. I livelli di espressione dei due neuronali specifici geni marcatori (ELAV e futsch) sono stati valutati da qRT-PCR. I valori ottenuti da queste analisi sono stati normalizzati al controllo endogeno (rp49), ed i livelli rispetto a quelli osservati in flusso attraverso frazione sono stati calcolati con il metodo ΔΔCτ ^6. Sia ELAV e futsch erano significativamente arricchito in isolati popolazione da neurone rispetto al flusso attraverso la frazione.

Figura 4: Rappresentante di classe IV da neuroni specifici Cy3 etichettati file immagine microarray. Qui è un Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) ibridato con Cy3-labeld RNA totale isolato dalla classe IV neuroni da purificata dalla magnetica ordinamento tallone. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 4.

Il protocollo presentato qui è ottimizzato per l'isolamento e la purificazione dei neuroni periferici che aderiscono strettamente alla superficie interna della cuticola terzo Drosophila instar larvale con una perla magnetica strategia di separazione delle cellule. Mentre abbiamo usato questo protocollo per isolare specificamente Drosophila neuroni da applicazioni di questo protocollo per l'isolamento di altri tipi di cellule che aderiscono alla cuticola in stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, muscolo, altri neuroni periferici) può essere adattato variando alcuni parametri e l'utilizzo di distinte GAL4, UAS-mCD8-GFP transgeni giornalista che l'etichetta del tipo di cellula o tipi di interesse. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato sia in perdita di funzione e guadagno di funzione approcci in cui un gene di interesse può essere clonato in un UAS-mCD8-GFP transgene che può essere accoppiato con un transgene GAL4 per dirigere sia gene- specifiche perdita di funzione (ad esempio UAS-RNAi) o il guadagno di funzione a un tipo di cellule di interesse. Ad esempio, nel caso di un fattore di trascrizione si può desiderare per identificare i geni potenzialmente up-o down-regolato in caso di perdita di funzione o guadagno di funzione espressione in un tipo di cellula di interesse. Isolando l'RNA totale dal tipo di cellula purificata di interesse tramite questo protocollo e l'utilizzo di questo RNA per eseguire profili di espressione microarray è possibile identificare i geni differenzialmente regolati che possono rappresentare bersagli a valle di regolazione trascrizionale che svolgono un ruolo di mediazione cambiamenti fenotipici all'interno della cellula .

Per l'ordinamento delle cellule successo, è essenziale dare attenzione ai passaggi critici evidenziati nel protocollo di cui sopra. Esempi di aree problematiche comuni che potrebbero richiedere qualche ulteriore risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione, a seconda del tipo di cellula, includono (1) bassa resa cellulare e (2) cellule aggregazione durante magnetico isolamento tallone. Nel primo caso, si può provare a ridurre la concentrazione di Liberase Blendzyme 3, e compensare aumentando dissociazione meccanica tramite douncing. Nel secondo caso, si può provare a ridurre l'intensità del campo magnetico applicando un strati singoli o multipli di nastro adesivo di laboratorio sul magnete.