Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

Allgemeine Kommentare zu Magnetic Bead Sortieren von Drosophila peripheren Neuronen (Total Timing für die Fertigstellung des Protokolls: 2.5-3 Stunden)

Standard-Laborverfahren für die Beibehaltung einer sauberen, RNAse freien Umgebung muss jederzeit beobachtet werden, um RNA-Abbau zu verhindern.

Wenn der Drosophila Larvencuticula seziert wird und in der Zelle Dissoziationspuffer, sind die peripheren Neuronen eines der letzten Zellen aus der Oberhaut zu lösen. Wir haben diese Eigenschaft genutzt und entwickelt dieses Protokoll, um die meisten der nicht-spezifischen Zellen aus der Oberhaut, wie Muskel-und Fett vor dem Isolieren der da Neuronen zu entfernen.

Mit etwas Übung kann das gesamte Protokoll erfolgreich in ca. 2,5 Stunden abgeschlossen sein. Die Herstellung von Antikörper-beschichteten Kügelchen müssen abgeschlossen sein, bevor das Experiment beginnt.

1. Vorbereitung Magnetic Beads zur Bindung Cells:

Dieser Schritt muss vor dem Start des Experiments abgeschlossen sein. Die vorbereiteten Kugeln können hergestellt und bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt.

1. Wash 100 ul der Dynabeads M-280 Streptavidin beschichteten Beads dreimal in PBS durch Resuspendieren in 500 ml frisches PBS und Pelletierung es in einem starken Magnetfeld jeder Zeit.
2. Schließlich resuspendieren die Perlen direkt in 100 ul unverdünnter biotinylierten Ratte anti-Maus-CD8a Antikörper (Antikörper-Konzentration von 100 pg / ml).
3. Inkubieren Sie die Mischung für 1 Stunde auf Eis mit gelegentlichem leichten Verwirbelung zur Sedimentation zu verhindern. [1 ul Dynabeads M-280 binden können 0,05-0,10 pg biotinylierte Antikörper].
4. Waschen Sie die Bead-Antikörper-Gemisch dreimal wie in Schritt 1.1 beschrieben, um die überschüssige Antikörper zu entfernen. Die magnetischen Beads werden jetzt mit Antikörper beschichtet und zur Verwendung bereit. Bewahren Sie die Bead-Antikörper-Gemisch in 100 ul 1X PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung.

2. Auswählen und Washing Larven: (10-15 Minuten)

1. Nehmen 30-50 Jahren abgestimmt dritten Larvenstadium und legen Sie sie in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1-1,2 ml 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 Minuten)
2. Schließen Sie den Schlauch und Wirbel es bei maximaler Einstellung dreimal für jeweils 1 Sekunde.
3. Mit einem feuerpolierte Pasteurpipette den Überstand verwerfen komplett. Wiederholen Sie die Wäsche (2,1) und Vortex (2,2) die Schritte 3-4 Mal, bis der Überstand wird sichtbar frei von jeglichen Speisen Partikel und Ablagerungen.
4. Kurz wiederholen Sie die Wäsche mit 1 ml 70% Ethanol und den Überstand verwerfen.
5. Waschen Sie die Larven zweimal mit 1 ml ddH2O und den Ãœberstand verwerfen.
6. Kurz wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 1 ml RNase-AWAY und den Überstand verwerfen.
7. Waschen Sie die Larven dreimal in 1 ml ddH2O um die vollständige Entfernung von RNase-AWAY zu gewährleisten.

3. Dissection: (10-12 Minuten)

1. Legen 10-12 Larven auf die Mitte eines Sylgard beschichtet 35mm Petrischale. Positionieren Sie sie leicht von einander entfernt. [Critical Schritt: Entsorgen Sie alle Larven, die scheinbar nicht auf der entsprechenden Entwicklungsstufe werden]
2. Schneiden Sie die vordere Spitze der Larven mit einer feinen Sezierung Schere für alle die Larven.
3. Mit ein paar dumpfe Dumont Nr. 5 Pinzette invertieren die Larven von innen nach außen. Stecken Sie ein ForceP im Larvencuticula den ganzen Weg bis zum hinteren Ende. Pinch die Spitzen der Zange zusammen, um das hintere Ende der Kutikula (Abbildung 1a) (versuchen Sie die Nagelhaut auf den Sylgard Oberfläche zu erleichtern) zu greifen. Mit der zweiten Pinzette, drücken Sie die Larvencuticula innen nach außen. [Critical Schritt: Versuchen Sie praktizieren diese Methode ein paar Mal, bevor die Zelle isoliert Experiment. Versuchen Sie, die Larven vollständig invertiert zu bekommen, um sicherzustellen, dass alle Weichteile, die Lösung für eine einfache Dissoziation ausgesetzt.]
4. Nach Sezieren 3-4 Larven, übertragen Sie sie sofort an die frische, eiskalte PBS (statt der Röhre auf Eis) in ein 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,4, bis alle benötigten Larven gesammelt werden (30-40 Larven in diesem Protokoll). [Critical Schritt:. Antizipieren 10-20% Verlust beim Präparieren und Dissoziation, und entsprechend zu planen]

4. Entfernung von lose anhaftenden unspezifische Zellen: (2-3 Minuten)

[Dieser Schritt hilft bei der Räumung von lose anhaftenden unspezifische Gewebe wie Fett Organe und ZNS.]

1. Nehmen Sie die 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem invertierten larvalen Kutikula und ersetzen Sie den Überstand mit etwa 700-800 ml frisches eiskaltes PBS.
2. Pulse-Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen 5 mal (3 Sekunden pro Puls) bei voller Geschwindigkeit.
3. Ãœberstand verwerfen und ersetzen Sie es mit etwa 700-800 ul frischem, eiskaltem PBS.
4. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 dreimal.
5. Resuspend der larvalen Kutikula in 400 ml frisches, eiskaltes PBS

5. Distanziert das Gewebe in einem einzigen Zellsuspension: (18-20 Minuten)

[Critical Schritt: Over-Dissoziation kann der Verlust der Zell-Oberflächenmarker was zu einer schlechten Zelle Ausbeute und geringe Lebensfähigkeit der Zellen verursachen. Die Larven Gewebe kann entweder durch mechanische Dissoziation (Beschallung, douncing), enzymatische Dissoziation (Trypsin, Collagenase etc.) oder eine Kombination von beiden trennen. Da diese Larven Gewebe schwer zu distanzieren sind, fanden wir, dass eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Dissoziation die besten Ergebnisse erzielt.]

1. Add 1,5 ul 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch Einheiten / Durchstechflasche), die Larvencuticula in 400 ul PBS suspendiert.
2. Vortex die Lösung 2-3 mal für jeweils 1 Sekunde bei maximaler Einstellung (Dies sollte die lose anhaftenden Zellen aus der Oberhaut in die Lösung zu entfernen).
3. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur (22-25 ° C) für 5 Minuten. [Entscheidender Schritt: Die Inkubationszeit großen Einfluss auf die endgültige cell sorting Effizienz. Die empfohlene Inkubationszeit sollte ausreichen, zur Auflockerung des Gewebes. Nicht mehr als 15 Minuten.]
4. Pulse-Wirbel der Röhre 20-30 mal bei maximalen Einstellungen für 2 Sekunden pro Puls auf Hochtouren. Dies sollte löst die Muskulatur und andere Gewebe in die Lösung. Überprüfen Sie einen kleinen Auszug aus der Lösung unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei jedem Schritt. (Mit der Erfahrung sollte man in der Lage sein auf das Niveau der Dissoziation zu bestimmen durch die Beobachtung der Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter einem Fluoreszenz-fähigen Stereo-Mikroskop)
5. Waschen Sie die Larven Nagelhaut 2-3 mal mit frischem, eiskaltem PBS resuspendieren und schließlich sie in 500 ml frisches, eiskaltes PBS mit 1% BSA.
6. Um zu vermeiden, die Larvencuticula Festhalten an der Glasoberfläche der 2 ml Kontes Gewebe Mühle und großer Freiraum Stößel, pre-coat das Gewebe Mühle und Mörser mit einem 1% BSA in PBS-Lösung und nach einem kurzen Spülen verwerfen BSA-Lösung. Anschließend mit einem feuerpolierte Pasteurpipette, übertragen Sie die Nagelhaut mit Schritt 5.5 die BSA-beschichtete Gewebe Mahlwerk. [Critical Schritt: Pre-cool das Gewebe Schleifer / Stößel, indem Sie sie auf Eis für ein paar Minuten zu Zellschädigungen / Lyse verhindern].
7. Dounce das Gewebe mit langsamen und gleichmäßigen Strichen, die Vermeidung Aufschäumdüse (ca. 20-30 Schläge). [Critical Schritt:. Dounce langsam und stetig, sonst können die Zellen zu lysieren]
8. Zur Beurteilung der Zell-Dissoziation Ebenen, wischen Sie die Außenwand des Gewebes Mahlwerk mit einem sauberen Kimwipe Gewebe, und untersuchen Sie ihn unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Neuronen sollte die Nagelhaut abgelöst haben, und können in der Lösung gesehen werden. Wenn diese gefunden wird schwierig sein, alternativ Pipette eine kleine Probe der Lösung, und beobachten Sie es unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Ein guter Indikator für Zelle Dissoziation ist die Abwesenheit von Neuronen aus dem Larvencuticula. Allerdings, wenn man noch beachtet Neuronen an der Nagelhaut oder beobachtet unvollständig dissoziierten Zellen, weitere Dounce, bis die Zellen erreichen einen einzigen Zellsuspension.
9. Man reibt die Lösung 5 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf etwa 50% der Standard-Spitzendurchmesser, gefolgt von 10 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf rund 25% der Standard-Durchmesser. [Critical Schritt: Kraftvoller Verreibung können die Zellen schädigen. Überwachen Sie die Zellen zwischen den Schritten, und passen Sie das Verfahren entsprechend].
10. Filter die Lösung durch ein 30 pm Zellfilter und sammeln Sie die Zelle Filtrat in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die resultierende Lösung sollte aus einem einzigen Zellsuspension bestehen und ist nun bereit für die magnetische Zellsortierung.

6. Magnetic Bead Cell Sorting: (45 bis 75 Minuten, abhängig von Antikörper-Inkubationszeit)

1. Add 15 ul Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen zu 500 ul Zellsuspension (Schritt 5,10). Die restlichen Antikörper, konjugiert magnetische Kügelchen können gespeichert werden, bis für die nachfolgende Zelle Isolierungen benötigt werden.
2. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen für 30-60 Minuten auf Eis mit gelegentlichen Hand-Mischen. [Critical Schritt: Inkubation bei einer höheren Temperatur oder längere Zeit kann in nicht-spezifische Antikörper-Bindung führen.]
3. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem starken Magnetfeld für 2 Minuten. Alle positiv selektierten Zellen zusammen mit ungebundenen Perlen werden auf die Seite des Rohres zu trennen.
4. Langsam Pipette der Überstand, was sicher nicht das Zellpellet zu stören.
5. Waschen Sie die Zellen 3-4 mal in frischem, eiskaltem PBS, um alle verbleibenden nicht-spezifische Zellen zu entfernen.
6. Resuspendieren der Zellen in 30 ml frisches, eiskaltes PBS.
7. Zur Angleichung der Reinheit und Ausbeute der Zellen, Pipette 5 ul der Zelle suspension auf der polierten Oberfläche einer Zählkammer und zählen alle sichtbaren fluoreszierenden Zellen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Überprüfen Sie auch die Menge an nicht-fluoreszierenden Zellen und keine Anzeichen von Verunreinigungen. Typischerweise wird die Probe in hohem Grade für fluoreszierende Zellen angereichert werden.

7. RNA Isolation aus Magnetic Bead sortierten Zellen: (60 bis 75 Minuten)

1. Nach dem Zählen Pellet die Zellen in einem Magnetfeld, den Überstand verwerfen und mit 20 ul Extraktionspuffer aus dem PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Je nach Zellzahl, den Sie benötigen, um ein höheres Volumen Extraktionspuffer hinzuzufügen.
2. Vortex das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit, damit die Vermischung von Zellpellet mit Extraktionspuffer.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 42 ° C für 30 Minuten.
4. Um sicherzustellen, Entfernung der magnetischen Kügelchen vor der Spalte Reinigung der RNA (siehe Schritt 7.5) wird das Rohr kurz auf 2.000 (x) g für 2 Minuten auf Pellet die magnetischen Kügelchen zentrifugiert. Das Rohr wird dann in einem starken Magnetfeld, das Pellet bewahren gelegt, und der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.
5. Extrahieren und Spalte reinigen die RNA nach dem PicoPure RNA-Extraktion-Kit des Herstellers. DNAse Behandlung ist optional und kann auf der Säule während der RNA-Reinigung werden nach der Analyse Anforderung durchgeführt. Schließlich eluieren die gebundenen Gesamt-RNA in einem kleinen Volumen (11-30 ul) Elutionspuffer und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Auf Wunsch eine 1 ul-Aliquot verwendet werden, um Gesamt-RNA Qualität auf einem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) zu beurteilen.

Repräsentative Ergebnisse:

Magnetic Bead-Sortierung verwendet wurde, um Drosophila da Neuronen (Abbildung 1) zu isolieren. Die RNA aus diesen isoliert da Neuronen (Abbildung 2a) gereinigt wurde festgestellt, dass von ausgezeichneter Qualität sein, wie durch das Vorhandensein von scharfen 5.8S, 18S und 28S ribosomalen RNA Spitzen angezeigt, wenn auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) analysiert ( Abbildung 2b). Beginnend mit 30-40 dritten Larvenstadium waren wir in der Lage zu isolieren durchschnittlich 300-500 Klasse-IV da Neuronen mit der PPK-GAL4 Treiber und 1500-2000 da Neuronen (Class I, II, III & IV) mit dem pan- da Neuronen-spezifische GAL4 ^21-7 Fahrer. Zur Beurteilung der neuronal-spezifische Anreicherung unserer isolierten Zellen führten wir quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) mit zwei neuronalen Gen-spezifische Marker (Elav und futsch). Diese Analysen zeigten signifikante fache Anreicherung der beiden Markergene was auf eine sehr spezifische Bereicherung für da Neuronen fließen durch den Einsatz unseres Protokolls (Abbildung 3) verglichen. Schließlich wurde die isolierte RNA aus beiden pan-da Neuronen und Klasse-IV da Neuronen zur transkriptionellen Expression Profiling auf Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarrays (4 x 44K) (Abbildung 4) durchzuführen. Diese Analysen wurden zahlreiche zuvor verwickelt Regulatoren da Neuron Dendriten Morphogenese neben einem breiten Spektrum von bisher nicht charakterisierter Moleküle und vermeintlichen Signaltransduktionswege, die möglicherweise spielen eine wichtige funktionelle Rolle in da Neuron Entwicklung. Studien entwickelt, um die potenzielle Rolle (n) dieser bisher nicht charakterisierter Moleküle bei der Vermittlung da Neuron Entwicklung, insbesondere Dendriten Morphogenese zu beurteilen, sind derzeit im Gange.

Abbildung 1:. Schematische Darstellung des Magnetic-Bead-Sortierung von Drosophila da Neuronen (a) Alter abgestimmt dritten Larvenstadium mit dem da Neuronen-spezifische GAL4, UAS-mCD8-GFP-Reporter-Transgen sind durch Umkehrung der Larvencuticula inside-out, um das Expose seziert PNS zur Dissoziation Puffer und in eiskaltem PBS gespeichert. (b) Enzymatische Dissoziation erfolgt durch Zugabe von Liberase Blendzyme 3, um die Lösung mit Larvencuticula durchgeführt. (c) Die Larven Gewebe sind weitere dissoziiert durch eine Kombination aus Verwirbelung, Zerreiben und douncing Nicht-spezifisch markierten Gewebe wie Fett-Organe, Darm und ZNS. (d, e) Die Zellen werden dann gefiltert mit einem 30 pm Zelle Filter zu entfernen. Die Lösung enthält eine einzige Zellsuspension von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelien, Muskel-und Nervenzellen. (F) Anti-Maus-Antikörper beschichtet CD8a Dynabeads M-280 sind zur Zellsuspension hinzugefügt und auf Eis inkubiert für 30-60 Minuten. ( g) Das magnetische Kügelchen bindet an die da Neuronen, die Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP Fusionsprotein. (h, i) Die Magnetic-Bead-beschichteten Zellen, indem die Lösung in einem starken Magnetfeld getrennt sind. Der Überstand wird verworfen und die Zellen dreimal gewaschen, um alle verbleibenden nicht-spezifischen Zellen zu entfernen, was in (j) highly gereinigt Populationen von Neuronen da. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Abbildung 2: (a) Repräsentative Bild von positiv selektierten, GFP Fluoreszenz-Klasse-IV da Neuronen durch Zell-Dissoziation und Magnetic-Bead-Sortierung isoliert. Die daraus resultierende Population von Neuronen war fest entschlossen, in hohem Grade für Klasse-IV da Neuronen werden mit wenig oder keiner Kontamination Zelle Verunreinigungen angereichert. (B) Ein Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektropherogramm Gesamt-RNA aus magnetischen Beads sortiert da Neuronen isoliert und zeigt eine ausgezeichnete Gesamt-RNA Qualität als durch die Anwesenheit von 5.8S, 18S und 28S rRNA angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Abbildung 3: qRT-PCR-Analyse von neuronalen Marker Genexpression in isolierten da Neuronen (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) und der Durchfluss durch-Fraktion wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Expression der beiden neuronal-spezifischen Markergene (Elav und futsch) wurden durch qRT-PCR untersucht. Die Werte aus diesen Analysen gewonnen wurden, um die endogene Kontrolle (rp49) normalisiert, und das Niveau im Vergleich zu denen in Durchströmung Bruchteil beobachtet wurden unter Zugrundelegung der ΔΔCτ Methode ^6. Beide Elav und futsch waren deutlich in der isolierten da Neuronenpopulation angereichert, um den Fluss durch Bruchteil verglichen.

Abbildung 4: Repräsentative Klasse-IV da Neuronen-spezifische Cy3 markiert Microarray-Image-Datei. Abgebildet ist ein Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarray (4 x 44K) mit Cy3-labeld Gesamt-RNA aus Klasse-IV da Neuronen durch Magnetic-Bead-Sortierung gereinigt isoliert hybridisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

Das Protokoll hier vorgestellten ist für die Isolierung und Aufreinigung von peripheren Neuronen, die eng an die innere Oberfläche der Drosophila dritten Larvenstadium Larvencuticula mit einer Magnetic-Bead-cell sorting Strategie festhalten optimiert. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um gezielt zu isolieren Drosophila da Neuronen, Anwendungen dieses Protokoll, um die Isolation von anderen Zelltypen, die die Kutikula in Larven-oder Puppenstadium Entwicklungsstadien haften (zB Epithelien, Muskeln, andere periphere Neuronen) kann durch Anpassung unterschiedlichen wenigen Parametern und mit verschiedenen GAL4, UAS-mCD8-GFP-Reporter Transgene, die die Zelle Art oder Arten von Interesse Etikett. Darüber hinaus kann dieses Protokoll in beiden loss-of-function-und Gain-of-function Ansätzen, bei denen ein Gen von Interesse in einen UAS-mCD8-GFP-Transgen, die mit einem GAL4 Transgen gekoppelt werden kann, um entweder direkt kloniert werden können, verwendet werden Gen- spezifische loss-of-Funktion (zB UAS-RNAi) oder gain-of-Funktion, um einen Zelltyp von Interesse. Zum Beispiel im Fall eines Transkriptionsfaktors kann man wünschen, um potenziell up-oder down-regulierten Gene auf loss-of-function oder gain-of-function Ausdruck in einem Zelltyp von Interesse zu identifizieren. Durch die Isolierung der Gesamt-RNA aus dem gereinigten Zelltyp von Interesse über dieses Protokoll und die Verwendung dieser RNA auf Microarray-Expression Profiling durchführen ist es möglich, differentiell regulierten Gene zu identifizieren, die möglicherweise hinter Ziele der Regulation der Transkription, die eine Rolle bei der Vermittlung phänotypische Veränderungen innerhalb der Zelle spielen vertreten .

Für eine erfolgreiche Zellsortierung ist es wichtig, sorgfältig auf die kritischen Schritte in dem obigen Protokoll hervorgehoben zu geben. Beispiele für gemeinsame Problemfelder, dass einige weitere Informationen zur Fehlerbehebung und Optimierung erfordern können, je nach Zelltyp, umfassen (1) niedrige Zellausbeute und (2) Zelle Verklumpung während Magnetic-Bead-Isolierung. Im ersten Fall kann man versuchen, die Verringerung der Konzentration von Liberase Blendzyme 3 und kompensieren durch eine Erhöhung mechanischen Dissoziation über douncing. Im zweiten Fall kann man versuchen, die Verringerung der magnetischen Feldstärke durch die Anwendung einer einzelnen oder mehreren Schichten von Klebstoff-Labor Klebeband über den Magneten.