Intranuclear mikroinjektion av DNA i dissocierade vuxna däggdjur Neuroner

Lu, V. B., Williams, D. J., Won, Y., Ikeda, S. R. Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons. J. Vis. Exp. (34), e1614, doi:10.3791/1614 (2009).

Primär neuronal cell kulturer är värdefulla verktyg för att studera proteiners funktion eftersom de står för en mer biologiskt relevanta system jämfört med förevigade cellinjer. Dock hindrar efter mitotiska natur primära neuroner effektiva heterologa protein uttryck med hjälp av gemensamma förfaranden som elektroporation eller kemiskt medierade transfektion. Därför måste andra metoder användas för att effektivt uttrycka proteiner i dessa icke-delande celler.

I denna artikel beskriver vi de åtgärder som krävs för att utföra intranuclear injektioner av cDNA konstruktioner i dissocierade vuxen sympatiska nervceller. Denna teknik, som har tillämpats på olika typer av nervceller, framgångsrikt kan framkalla heterologa protein uttryck. Den utrustning som krävs för att mikroinjektion förfarandet ingår ett inverterat mikroskop för att visualisera celler, ett glas injektion pipett fylld med cDNA lösning som är ansluten till en N _{2 (g)} tryck leveranssystem, och en mikromanipulator. Den mikromanipulator samordnar injektion rörelse mikroinjektion pipett med en kort puls av trycksatta N ₂ för att mata ut cDNA lösning från pipettspetsen.

Denna teknik har inte toxiciteten som är förknippad med många andra transfektion metoder och gör att flera DNA-konstruktioner för att komma till uttryck på ett konsekvent förhållande. Det låga antalet injicerade cellerna gör mikroinjektion förfarande lämpar sig väl för enskild cell studier som elektrofysiologiska inspelningar och optisk avbildning, men kan inte vara perfekt för biokemiska analyser som kräver ett större antal celler och högre effektivitet transfektion. Även intranuclear microinjections kräver en investering av utrustning och tid, gör att möjligheten att uppnå höga nivåer av heterologa proteinuttryck i en fysiologiskt relevant miljö denna teknik ett mycket användbart verktyg för att undersöka proteiners funktion.

I. Förberedelse för injektion

Detta avsnitt beskriver förberedelserna steg som måste vidtas innan injicera cDNA in i kärnan av nervceller. Isoleringen Förfarandet för nervceller är utanför ramen för denna artikel, men det är viktigt att ha nervceller dissocierade i enskilda celler och följa väl till botten yta 35 kultur mm cell rätter (se diskussion för tips för att uppnå detta). Även om en mängd olika nervceller skulle kunna utnyttjas, är perifera ganglier som den överlägsna livmoderhalscancer ganglierna (SCG) eller dorsalrotsganglier föredra för dissektion eftersom de är lätt tillgängliga och ger ett stort antal nervceller. Ytterligare fördelar med att använda SCG nervceller är att de är en relativt homogen population av celler och väldefinierad ^1,2,3,4.

A. Beredning av plasmid cDNA för injektion

1. Att undvika föroreningar eller nedbrytning av DNA, bör skyddshandskar bäras under beredning.
2. DNA som kodar för proteinet av intresse är subcloned i en lämplig däggdjur uttryck vektor, såsom PCI (Promega, Madison, WI), reglerad av högt och konstitutivt aktiv cytomegalovirus (CMV) promotor. Om proteinet inte är märkt, en reporter plasmid är kodning EGFP till exempel (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Kalifornien), co-injicerade att bekräfta lyckad injektion och uttryck. DNA isoleras med hjälp av en hög pelare kvalitet separation (t.ex. QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) och ytterligare renas med hjälp av en centrifugal Filtersystem med en PVDF filter (0,1 ìm, Millipore, Bedford, MA) för att avlägsna partiklar i plasmid förberedelse, vilka kan täppa till injektion pipetter under injektionen processen. Plasmider lagras vid -20 ° C vid en koncentration av ca 1 mikrogram / l på ett lämpligt DNA lagring buffert (t.ex. TE buffert: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
3. Omedelbart före mikroinjektion, är plasmid cDNAs späds ut och blandas till önskad slutlig koncentration i TE buffert eller H ₂ O. Normalt 5-10 ng / l av reportern genen är tillräckligt för att etiketten injiceras celler, och den totala koncentrationen av cDNA som injiceras bör inte överstiga 200 ng / l eftersom DNA är trögflytande vid höga koncentrationer och kan täppa injektion pipetter. En liten volym cDNA för injektion (5-10 l) bereds genom att blanda droppar av lösningen på den rena ytan av en liten bit av Parafilm (sida under pappersförstärkning). Blanda droppar av lösningen tillsammans med pipeting upp och ned flera gånger med en pipetor och undvika att införa luftbubblor under omrörning.
4. Använda ett tips microloader pipett (Eppendorf, Brinkmann Instrument, Westbury, NY), överför cDNA lösningen på en särskilt preparerad hematokrit slang (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Se material avsnitt för instruktioner om att förbereda hematokrit tuber (Material tabell). Placera hematokrit röret med cDNA injektion lösningen i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
5. Centrifugera röret i 15 till 30 minuter vid 10 000 gi en mikrocentrifug utrustad med en fast vinkel eller svängande hink rotor (Eppendorf), vid rumstemperatur (20-24 ° C) till sediment partiklar i cDNA lösning som kan blockera mikroinjektion pipett. Den cDNA injektion lösning kan förvaras i rumstemperatur under injektionen sessionen.

B. Tillverkning av injektion pipetter

1. Disponibel glas mikroinjektion pipetter finns kommersiellt tillgängliga (t.ex. Femtotips, Eppendorf), som är bekvämt men dyrt ($ 10 per mikroinjektion pipett). Injektion pipetter kan tillverkas i laboratoriet med hjälp av en programmerbar P-97 Flaming Brun pipett avdragare (Sutter Instrument Company, Novato, CA) och filamented, tunnväggiga borosilikatglas kapillärrör (World precisionsinstrument, Sarasota, FL). Detta alternativ är mer kostnadseffektivt och ger möjlighet till styrning av mikroinjektion pipett form och storlek.
2. En två-stegs program används för att dra smala tips mikroinjektion pipett. Sedan öppnandet av mikroinjektion pipetter är för smal för att undersöka, under ett ljusmikroskop, kvaliteten på injektion pipetter måste utvärderas direkt genom att injicera ett fåtal celler innan programmet inställningarna är klara. Följande är ungefärliga inställningar för värme, drag, hastighet och tid: (pull 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Dessa inställningar varierar med olika partier av glas och av tillståndet för uppvärmning glödtråden i avdragare, och ska anpassas efter behov. För mer information se ^5.
3. Dra flera (2-5) injektion pipetter per maträtt av nervceller som ska injiceras, i händelse av skador eller problem under injektionen sessionen. Förvara injektion pipetter i en täckt behållare för att förhindra att damm kommer in i spetsen mikroinjektion pipett.

II. Intranuclear mikroinjektion

Den ideala tiden för att injicera SCG nervceller är 3-6 timmar efter dissociation. I detta skede cellerna är sfäriska, tätt knuten till botten av skålen, och kärnan är väl synlig, under en faskontrastmikroskop, som en central rund organell med en mörk membran, som innehåller en enstaka eller flera nukleolerna (Figur 1A).

1. Placera ett fat dissocierade nervceller i mitten av mikroskop scenen. Justera fokus och optimera optik faskontrast av mikroskopet så att kärnor av nervceller syns tydligt.
2. Pipettera 2 ìl av beredd cDNA-lösningen till en mikroinjektion pipett med ett tips microloader pipett. Undvik att utarbeta lösning nära botten av hematokrit röret eftersom detta kan röra upp partiklar som reglerades under centrifugering. Glödtråden i mikroinjektion pipetter bör stöd i utarbetandet lösning på toppen, men om små luftbubblor kvar, knacka försiktigt på sidan av glaset för att lossa dem.
3. Sätt mikroinjektion pipettera i kapillära innehavaren av trycket injektorn och därefter fast hållaren till mikromanipulator. Hållaren är fast i 45 ° vinkel.
4. Sänk mikroinjektion pipettera i skålen. Som pipettera går in i ett odlingsmedium är en menisk bildas som påverkar ljusets brytning och sänker bildkvaliteten hos nervceller. För att lindra detta problem kan fasen ringen tornet vara något förskjutna till kärnor av nervceller syns tydligt igen.
5. Några tryck injektion system har en "ren"-funktion som gäller maximalt lufttryck från mikroinjektion pipettspetsen för en kort tid. Använd denna funktion för att rensa Pipettera av skräp innan och under injektion om spetsen verkar tilltäppt. Om skingrade vätska syns inte på skärmen när du använder denna funktion, ersätta med en ny injektion pipett.
6. Centrera mikroinjektion pipettera i visningsområdet övervaka och anpassa spetsen bredvid en neuron och i samma fokalplanet som kärnsystemet. Ange den här positionen som den lägre z-axeln gräns för mikromanipulator. Denna position är djupet i mikroinjektion pipett kommer att avancera till under injektioner. Placera nu spetsen cirka 30 ìm ovanför denna punkt så mikroinjektion pipettera rensar toppen av nervceller.
7. Den "injicera" läge för en Eppendorf 5171 mikromanipulator kan definieras med följande inställningar för att utföra intranuclear injektioner. Den injicerar funktion är aktiverad, medan spetsa funktionen slutade. En diagonal injektion stig (längs x-och z-axel) ger minsta cellskador, och därmed den axiella läget skall användas för injektionsvätskor. En injektion hastighet av 300 um / s är tillräcklig, och synkronisera tryckuppbyggnad när mikroinjektion pipettera når in z-axeln gräns.
8. Trycket injektorn styr mängden cDNA lösning sprutas in i kärnan. I "automatiskt" injektion läget är leverans av DNA tidsstyrda och initieras av det anslutna mikromanipulator. Injektionen tryck (Pi) bör sättas mellan 100 till 200 hPa (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi), högre insprutningstryck inte förbättras framgångsrika eller kvalitet injektioner och kan indikera andra problem med mikroinjektion pipettspetsen storlek eller DNA renhet . En injektion varaktighet (TI) i 0,3 s och en kompensation tryck (Pc) på 30 hPa, som levererar ett konstant övertryck för att undvika införsel av blockerade partiklar från odlingsmediet i pipettspetsen, bör användas.
9. Placera neuron som ska injiceras under toppen av mikroinjektion pipettera hjälp av mikroskop är xy-axel skede kontroll. Rikta spetsen på pipettera ovanför centrum av kärnan genom att fokusera och tillbaka mellan than spetsen och nukleolerna.
10. Injicera kärnan genom att trycka på injicera knappen (på mikromanipulator). För injektionen steget, är rörelsen av mikroinjektion pipett och frisläppandet av cDNA-lösning kontrolleras av mikromanipulator. Det är svårt att bekräfta en framgångsrik intranuclear injektioner med ögat, men injektion av relativt låg viskositet cDNA-lösning (jämfört med viskösa nukleär miljö), ofta visas som en vit plym i faskontrast optik och kan användas som en indikator på injektion in i kärnan. Ibland mikroinjektion Pipettera inte tränger det nukleära membranet och bara knuffar kärnan. En andra injektion försök på samma position kan leda till en lyckad injektion av DNA i cellkärnan. Svullnad av cellen är oftast ett tecken på oavsiktliga cytoplasmiska injektion. Dessutom är betydande kärnkraft svullnad inte tolereras väl av nervceller och oftast resulterar i celldöd strax därefter, och därför bör insprutningstryck och varaktighet inte överstiger den föreslagna värden.
11. Fortsätt att injicera nervceller genom att omplacera mikroskop skede att anpassa nästa neuron under mikroinjektion pipett. Systematiskt navigera genom skålen för att injicera ca 50-100 kärnor innan han återvände skålen av nervceller till inkubatorn för övernattning inkubation. Framgångsrikt injicerade nervceller kan identifieras följande dag av uttryck av reporter genen.

III. Representativa resultat

Figur 1: Superior livmoderhalscancer ganglion (SCG) nervceller.
Faskontrast bild av SCG nervceller 3 timmar efter dissociation (A). I detta skede är kärnan syns tydligt som stöd anpassning av mikroinjektion pipettspetsen. Kärnan visas i mitten av nervceller med en enda (vänster) eller flera (höger) mörk nukleolerna.
SCG nervceller 16 timmar efter injektion av EGFP cDNA in i kärnan (B). Vänster, SCG nervceller ses under faskontrast belysning. Höger, epifluorescent bild av samma nervceller som visar framgångsrika injektion och leder EGFP uttryck i ett neuron.
Vit skala bar är 20 mikrometer.

Bild 2: Hel-cells inspelningar av strömmar genom heterologously-uttryckta G-proteinkopplade invärtes avhjälpa K ⁺ (GIRK) kanaler från SCG nervceller.
GIRK ström (I _GIRK) var framkallade av en 200 ms spänningsramp från -140 till +40 mV från en anläggning potential -60 mV (indrag A) efter aktivering av endogena α _{2-adrenoreceptorer} av noradrenalin (NE, 10 mikrometer) . Överlagrade spår är inspelningar från samma neuron och ange före (svart) och efter applicering av antingen NE ensam (blå) eller NO plus 10 mM Ba ^{2 +} (röd). Streckade linjerna anger noll nuvarande nivå.
För inspelning jag _GIRK, den externa lösningen som finns (i mm) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl _2, 0,8 MgCl _2, 15 glukos, 15 sackaros och 0,0003 TTX, justerat till pH 7,4 med NaOH. Den interna inspelning lösningen som finns (i mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 HEPES, 4 MgATP och 0,3 Na ₂ GTP, justerat till pH 7,2 med KOH.
Bristen på aktuella framkallades av spänningen rampen i närvaro av noradrenalin i uninjected SCG neuron (A) visar att SCG nervceller inte uttrycker endogena GIRK kanaler. Framgångsrik injektion av plasmid cDNA koda en funktionell GIRK kanal ¹¹ ger upphov till stora strömmar under spänningsramp när den utsätts för NE (B, vänster). Strömmar har de typiska kännetecknen för strömmar genom GIRK kanaler: aktivering genom en kombination G-proteinkopplade receptor agonist (NE), aktiv rättelse, och block av strömmar av den förmodade GIRK-blockerare, Ba ^{2 +} (b, höger rött spår). Öppna och fyllda cirklar representerar jag _GIRK till anläggningen och toppström, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Vanliga problem och förslag:

Som tidigare nämnts framgångsrika nukleära injektioner beror på att behöva celler anhängare till plattor vävnadskultur. Att skjuta upp starten av injektioner några timmar efter den cell dissociation förfarandet ger nervceller att hålla sig till botten av rätter. Dessutom beläggning rätter med 0,1 mg / ml med hög molekylvikt, poly-L-lysin (Sigma, St Louis, MO) stöd vidhäftning av nervceller till botten yta rätter.

Blockering av mikroinjektion pipetter, speciellt när man försöker injicera en hög koncentration av DNA, kan vara ett vanligt problem. Med hög kolumner kvalitet separation för att isolera och rena plasmid-DNA och utföra de ytterligare reningssteg nämns (spin-filter, spinning av hematokrit tuber) kan hjälpa att ta bort partiklar innan injicering. Under injektioner kan "rena" funktion av trycket injektorn skall användas (0,2 s är tillräckligt), men om det inte löser problemet, bör en ny injektion pipett användas. Om majoriteten av mikroinjektion pipetter bli igensatta under en injektion session överväga att ändra inställningarna i glaset pipett avdragare för att producera tips mikroinjektion pipett med en större öppning.

En annan fråga som uppstår vid kärnkraft injektioner är ojämnheter på undersidan av rätter vävnadskultur. Denna variation påverkar direkt rikta riktigheten av tips injektion pipett till kärnan eftersom djupet i pipett korsar under injektioner är fast. Därför måste detta z-axeln gräns justeras under loppet av injektionerna inom samma maträtt. Det blir tydligt när en justering är nödvändig: blir det ingen indikation på kärnkraft injektion (ingen vit plym i kärnan eller cellen missas helt), eller för insprutning pipettspetsen närmar sig botten av skålen (komprimera cellen eller till och med kraschar pipettspetsen i botten av skålen). Glas-kloning cylindrar (. OD 10 mm, Cat nr 2090-01.010, Bellco Glas, Vineland, NJ) kan användas under plätering av nervceller för att begränsa dem i en mindre, mer begränsat område, därför att minimera avståndet som krävs för att flytta injektionen pipett mellan injektionerna. Dessa kloning cylindrar tas bort innan du utför microinjections.

Nackdelar med tekniken:

Intranuclear microinjections är tekniskt krävande, som kräver tålamod och en hög grad av manuell skicklighet av operatören. Färdighet med denna teknik, som med alla andra färdigheter, kommer med praktik. Därför är det tillrådligt att träna nukleära injektioner av reporter genen ensam innan själva experiment. För att ytterligare underlätta injektionen processen, kan det vara möjligt att konsolidera stegen i mikromanipulator och påtryckningar injektor i ett datorprogram. Program som Igor Pro (WaveMetrics, Portland, OR) kan användas för att lagra mikroinjektion inställningar och programmera multifunktionella styrenheter (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) till semi-automatisera injektion processen (se 6,7,8 för detaljer).
En annan nackdel med de intranuclear mikroinjektion tekniken är den låga andelen framgångsrika. Cirka 10-20% av försök till kärnkraft injektioner leda till protein uttryck. Även denna effektivitet kan vara tillräckligt för applikationer som inte kräver ett stort antal uttrycker celler, elektrofysiologi till exempel för olika biokemiska analyser kan detta inte vara tillräckligt.

Tillämpningar av teknik:

Trots sina nackdelar är intranuclear mikroinjektion av DNA en mycket användbar teknik för heterologously uttrycka proteiner i nervceller.

Höga nivåer av proteinuttryck uppnås med kärnvapen microinjections på grund av det stora antalet plasmider ut i kärnan under injektioner, en mycket aktiv CMV promotor som reglerar transkription av gener och långa stabilitet plasmider i kärnan. Protein över-uttryck är särskilt användbart i dominerande-negativa experiment där höga halter av heterologa proteiner som krävs för att överväldiga den endogena proteinet. En annan fördel med intranuclear injektioner är förmågan att leverera en konsekvent del av cDNA konstruktioner till kärnan när flera konstruktioner injiceras. Med andra transfektion metoder är det svårt att reproducerbart införa samma andel av varje DNA bygga in i olika celler inom samma maträtt och mellan transfections. Direkt injektion av cDNA lösning i kärnan eliminerar denna källa till variabilitet och gör förhållandet uttryckt proteiner som ska titered effektivt.

Traditionella transfektion metoder har begränsad effektivitet i post-mitotiska celler på grund av låga inkorporeringen av DNA i cellkärnan ⁹ och kemisk toxicitet i samband med transfektion REAGmedelsingredienser ^10. Kärn microinjections övervinna dessa problem genom att införa genetiskt material mekaniskt in i kärnan. Även om denna teknik är mer engagerade, förmågan att studera effekten av ett protein i en fungerande biologiskt system, komplett med endogena signalvägar, mer än kompenserar för den mödosamma karaktären på denna teknik.

Alla experimentella procedurer på djur har utförts i enlighet med National Institutes of Health: s riktlinjer för djurens skötsel och användning.

Vårt laboratorium forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, National Institute on alkoholmissbruk och alkoholism.

1. Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol 85, 179-206 (1935).
2. Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature 380, 255-258, (1996).
3. Schofield, G. G. & Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res 485, 205-214, (1989).
4. Schofield, G. G. & Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch 411, 481-490, (1988).
5. Dean, D. A. in Live Cell Imaging: a Laboratory Manual Vol. 1 (ed Robert D, Goldman, David L. Spector) Ch. 4, 51-66 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2005).
6. Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol 83, 191-202, (1997).
7. Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol 259, 167-181, (2004).
8. Ikeda, S. R. & Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons. Methods Enzymol 389, 170-189, (2004).
9. Washbourne, P. & McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol 12, 566-573, (2002).
10. Zhang, Y. & Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays 30, 606-610, (2008).
11. Vivaudou, M. et al. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem 272, 31553-31560, (1997).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.