Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Lu, V. B., Williams, D. J., Won, Y., Ikeda, S. R. Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons. J. Vis. Exp. (34), e1614, doi:10.3791/1614 (2009).

Colture primarie di cellule neuronali sono strumenti preziosi per lo studio della funzione delle proteine ​​in quanto rappresentano un sistema più biologicamente rilevanti rispetto alle linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, il post-mitotico natura di neuroni primari impedisce un'efficace espressione eterologa proteine ​​mediante procedure comuni come l'elettroporazione o chimicamente mediata trasfezione. Così, altre tecniche devono essere impiegati per esprimere efficacemente le proteine ​​in queste cellule non si dividono.

In questo articolo, si descrivono i passaggi necessari per eseguire iniezioni intranucleari di costrutti di cDNA dissociato in neuroni adulti simpatico. Questa tecnica, che è stata applicata a diversi tipi di neuroni, possono con successo indurre l'espressione di proteine ​​eterologhe. L'attrezzatura indispensabile per la procedura di microiniezione comprende un microscopio invertito per visualizzare le cellule, una pipetta di iniezione di vetro riempita con una soluzione di cDNA che è collegato ad un ₂ N _(g), sistema di pressione di consegna, e di un micromanipolatore. Il micromanipolatore coordina il movimento iniezione di pipetta microiniezione con un breve impulso di pressione N ₂ per espellere soluzione cDNA dalla punta pipetta.

Questa tecnica non ha la tossicità associata a molti metodi di trasfezione altri costrutti del DNA e permette più di essere espresso con un rapporto costante. Il basso numero di cellule iniettate rende la procedura di microiniezione adatto per gli studi di singola cellula, come le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging ottico, ma potrebbe non essere l'ideale per le analisi biochimiche che richiedono un numero maggiore di cellule e l'efficienza di trasfezione superiore. Anche se microiniezioni intranucleari richiedono un investimento di attrezzature e di tempo, la capacità di raggiungere alti livelli di espressione della proteina eterologa in un ambiente fisiologicamente rilevanti rende questa tecnica uno strumento molto utile per studiare la funzione delle proteine.

I. Preparazione per l'iniezione

Questa sezione descrive le fasi di preparazione che devono essere prese prima di iniettarlo cDNA nel nucleo dei neuroni. La procedura di isolamento per i neuroni è oltre la portata di questo articolo, ma è importante avere i neuroni dissociate in singole cellule e ben aderente alla superficie inferiore di 35 millimetri dishes cellule cultura (vedi discussione per consigli utili per raggiungere questo obiettivo). Anche se una serie di neuroni diversi potrebbero essere utilizzati, gangli periferici come i gangli cervicale superiore (SCG) o gangli delle radici dorsali sono da preferire per la dissezione perché sono comodamente accessibili e produrre un gran numero di neuroni. Ulteriori vantaggi di usare i neuroni SCG è che sono una popolazione relativamente omogenea di cellule e ben caratterizzati ^1,2,3,4.

A. Preparazione del plasmide cDNA per l'iniezione

1. Per prevenire la contaminazione o rottura del DNA, i guanti dovrebbero essere indossati durante la preparazione.
2. DNA che codifica per la proteina di interesse è subcloned in un vettore adatto espressione mammiferi, come il PCI (Promega, Madison, WI), ai sensi del regolamento del altamente e costitutivamente attiva da citomegalovirus (CMV) promotore. Se la proteina non è etichettato, un reporter plasmide, EGFP codifica per esempio (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), è co-iniettata per confermare l'iniezione di successo e di espressione. Il DNA è isolato con una alta colonna di separazione di qualità (ad esempio QIAfilter Midi-preparazione kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e ulteriormente purificato con una unità di centrifuga filtro con un filtro di PVDF (0,1 micron, Millipore, Bedford, MA) per rimuovere le particelle in preparazione plasmide, che può ostruire pipette iniezione durante il processo di iniezione. I plasmidi sono conservati a -20 ° C ad una concentrazione di circa 1 mg / mL in un buffer adeguato stoccaggio del DNA (es. tampone TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
3. Immediatamente prima di microiniezione, cDNA plasmidico sono diluiti e mescolati alla concentrazione finale desiderata in TE buffer o H ₂ O. Tipicamente, 5-10 ng / ml di gene reporter è sufficiente per etichettare le cellule iniettate, e la concentrazione totale di cDNA da iniettare non deve superare i 200 ng / mL dato che il DNA è viscoso ad alte concentrazioni e può ostruire pipette iniezione. Una piccola quantità di cDNA per l'iniezione (microlitri 5-10) si prepara mescolando gocce di soluzione sulla superficie pulita di un piccolo pezzo di Parafilm (lato sotto lo strato di carta). Mescolare le gocce di soluzione insieme da pipeting su e giù più volte con un pipetor ed evitare l'introduzione di bolle d'aria durante la miscelazione.
4. Utilizzando una punta pipetta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), trasferire la soluzione cDNA ad un tubo di ematocrito appositamente preparato (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vedere la sezione materiali per le istruzioni sulla preparazione dei tubi di ematocrito (tabella materiali). Posizionare il tubo contenente la soluzione ematocrito cDNA iniezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
5. Centrifugare la provetta per 15-30 minuti a 10 000 g in una microcentrifuga dotato di un rotore ad angolo fisso o oscillante (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) per particelle di sedimento nella soluzione cDNA che possono bloccare le microiniezione pipetta. La soluzione iniettabile cDNA possono essere conservati a temperatura ambiente durante la sessione di iniezione.

B. Realizzazione di pipette di iniezione

1. Pipette monouso microiniezione di vetro sono disponibili in commercio (ad esempio Femtotips, Eppendorf), che sono convenienti ma costoso ($ 10 per ogni pipetta microiniezione). Pipette di iniezione può essere prodotto in laboratorio utilizzando un programmabile P-97 estrattore Flaming pipetta Brown (Instrument Company Sutter, Novato, CA) e filamented, a pareti sottili tubi di vetro borosilicato capillare (Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL). Questa opzione è più conveniente e consente il controllo di forma e dimensione microiniezione pipetta.
2. A due stadi programma viene utilizzato per tirare strette puntali microiniezione. Dal momento che l'apertura di pipette microiniezione è troppo stretto per esaminare al microscopio ottico, la qualità di pipette di iniezione devono essere valutate direttamente iniettando poche cellule prima che le impostazioni del programma sono finalizzati. Di seguito sono approssimativi impostazioni per le impostazioni di calore, tirare, velocità e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Queste impostazioni variano a diversi lotti di vetro e dalla condizione del filamento di riscaldamento l'estrattore, e deve essere adattata alle necessità. Per maggiori dettagli vedi ^5.
3. Tirare diversi (2-5) pipette di iniezione per ogni piatto di neuroni da iniettare, in caso di danni o problemi durante la sessione di iniezione. Pipette iniezione di conservare in un recipiente coperto, per evitare che la polvere di entrare la punta della pipetta microiniezione.

II. Microiniezione intranucleari

Il momento ideale per iniettare neuroni SCG è di 3-6 ore dopo la dissociazione. A questo punto, le cellule sono sferiche, strettamente collegato al fondo del piatto, e il nucleo è chiaramente visibile, sotto un microscopio a contrasto di fase, come una centrale rotondo organello con una membrana scura, contenente un singolo o più nucleoli (Figura 1A).

1. Posizionare un piatto di neuroni dissociato al centro del palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e ottimizzare l'ottica a contrasto di fase del microscopio così i nuclei dei neuroni sono chiaramente visibili.
2. Pipettare 2 ml di soluzione preparata cDNA in una pipetta microiniezione con una punta di pipetta microloader. Evitare di elaborare una soluzione vicino al fondo della provetta ematocrito dal momento che questo può suscitare le particelle che si stabilì durante la centrifugazione. Il filamento in pipette microiniezione dovrebbero aiutare nel disegno soluzione per la punta, ma se persistono piccole bolle d'aria, picchietti leggermente la parte del vetro per rimuoverli.
3. Inserire la pipetta microiniezione nel supporto capillare della pressione degli iniettori e quindi fissare il supporto al micromanipolatore. Il titolare è fissato ad un angolo di 45 °.
4. Abbassare la pipetta microiniezione nel piatto. Come la pipetta entra nel terreno di coltura, si forma un menisco che influisce sulla rifrazione della luce e riduce la qualità dell'immagine dei neuroni. Per alleviare questo problema, la torretta anello di fase può essere leggermente spostata fino a quando i nuclei dei neuroni sono ancora chiaramente visibili.
5. Alcuni sistemi di pressione di iniezione hanno una funzione "pulito" che si applica la massima pressione d'aria dalla punta microiniezione pipetta per una breve durata. Utilizzare questa funzione per cancellare la pipetta di detriti prima dell'inizio e durante le iniezioni, se la punta sembra intasato. Se il liquido disperso non è visibile sullo schermo durante l'utilizzo di questa funzione, sostituire con una pipetta nuova iniezione.
6. Centro la pipetta microiniezione nel monitor di visualizzazione e allineare la punta accanto a un neurone e nello stesso piano focale come il nucleolo. Impostare questa posizione più bassa l'asse z limite al micromanipolatore. Questa posizione è la profondità della pipetta microiniezione avanzeranno al durante le iniezioni. Ora la posizione della punta di circa 30 micron di sopra di questo punto quindi la pipetta microiniezione cancella la parte superiore dei neuroni.
7. La modalità di "iniettare" di un micromanipolatore 5171 Eppendorf può essere definito con le seguenti impostazioni per eseguire iniezioni intranucleari. Il iniettare funzione è attiva, mentre la funzione di impalare è lasciato. Un percorso di iniezione diagonale (lungo la X e Z-asse) produce la minor quantità di danno cellulare, e quindi la modalità assiale deve essere utilizzato per preparazioni iniettabili. Una velocità d'iniezione di 300 micron / s è sufficiente, e sincronizzare l'accumulo di pressione quando la pipetta microiniezione raggiunge la serie z limite.
8. La pressione iniettore controlla la quantità di soluzione cDNA iniettato nel nucleo. Nella modalità "automatico" di iniezione, la consegna del DNA è a tempo controllato e avviato dal micromanipolatore collegati. La pressione di iniezione (Pi) dovrebbe essere impostata tra 100-200 ettopascal (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); pressioni d'iniezione superiori non migliorano i tassi di successo o la qualità delle iniezioni e può indicare altri problemi con le dimensioni punta microiniezione pipetta o la purezza del DNA . Una durata di iniezione (ti) di 0,3 s ed una pressione di compensazione (Pc) di 30 hPa, che fornisce una pressione costante positiva a evitare l'entrata di occlusione particelle dal mezzo di coltura in la punta della pipetta, dovrebbe essere usato.
9. Posizionare il neurone per essere iniettato sotto la punta della pipetta microiniezione utilizzando il microscopio assi xy controllo stadio. Allineare la punta della pipetta sopra il centro del nucleo, concentrandosi avanti e indietro tra tlui punta e nucleoli.
10. Iniettare il nucleo premendo il pulsante di iniettare (in micromanipolatore). Per la fase di iniezione, il movimento della pipetta microiniezione e il rilascio della soluzione di cDNA sono controllati dal micromanipolatore. E 'difficile confermare il successo iniezioni intranucleari ad occhio, ma l'iniezione della soluzione di viscosità relativamente bassa cDNA (rispetto per l'ambiente viscoso nucleare), appare spesso come una piuma bianca in contrasto di fase ottica e può essere utilizzato come indicatore di iniezione nel nucleo. A volte la pipetta microiniezione non penetra la membrana nucleare e trilli semplicemente il nucleo. Un tentativo seconda iniezione nella stessa posizione può portare ad una iniezione di successo del DNA nel nucleo. Rigonfiamento della cellula è di solito indicativa di involontaria iniezione citoplasmatica. Inoltre, significativo rigonfiamento nucleare non è ben tollerato dai neuroni e di solito porta alla morte cellulare subito dopo, così, la pressione di iniezione e la durata non deve superare i valori suggeriti.
11. Continua iniettando neuroni, riposizionando la fase microscopio per allineare il neurone successivo sotto la pipetta microiniezione. Sistematicamente navigare attraverso il piatto di iniettare circa 50-100 nuclei prima di tornare il piatto dei neuroni per l'incubatore per l'incubazione durante la notte. Neuroni con successo iniettato può essere identificato il giorno successivo dalla espressione del gene reporter.

III. Rappresentante Risultati

Figura 1: ganglio cervicale superiore (SCG) neuroni.
Contrasto di fase della SCG neuroni 3 ore successive alla dissociazione (A). In questa fase, il nucleo è chiaramente visibile che favorisce l'allineamento della punta della pipetta microiniezione. Il nucleo appare al centro di neuroni con un singolo (a sinistra) o multipla (a destra) nucleoli scuro.
SCG neuroni 16 ore dopo l'iniezione di EGFP cDNA nel nucleo (B). Sinistra, SCG neuroni visto sotto a contrasto di fase illuminazione. A destra, immagine epifluorescente dei neuroni stessi che mostra l'iniezione di successo e conseguente espressione di EGFP in un neurone.
Barra di scala bianca è di 20 micron.

Figura 2: Whole-cell registrazioni delle correnti attraverso heterologously-espresso proteine ​​G accoppiate interiormente rettificazione K ⁺ (GIRK) canali da SCG neuroni.
GIRK correnti (I _GIRK) sono stati evocati da una rampa di tensione di 200 ms da -140 a +40 mV da un potenziale di detenzione di -60 mV (inserto di A) dopo l'attivazione del endogena α _{2-adrenergici} di noradrenalina (NE, 10 mM) . Tracce sovrapposte sono registrazioni dal neurone stesso e indicare prima (nero) e dopo l'applicazione di uno solo NE (blu) o NE più 10 mM Ba ^{2 +} (rosso). Le linee tratteggiate indicano il livello zero di corrente.
Per la registrazione io _GIRK, la soluzione esterna contenuta (in mm) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl _2, 0,8 MgCl _2, 15 di glucosio, 15 saccarosio, e 0,0003 TTX, portato a pH 7.4 con NaOH. La soluzione di registrazione interna contenuta (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl _{2, 2} MgCl _2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na ₂ GTP, portato a pH 7.2 con KOH.
La mancanza di corrente suscitato dalla rampa di tensione in presenza di NE in uninjected neuroni SCG (A) dimostra che i neuroni SCG non esprimono canali GIRK endogena. Iniezione di successo di plasmide codifica cDNA un funzionale GIRK canale ¹¹ dà luogo a grandi correnti durante la rampa di tensione quando esposto a NE (B, a sinistra). Le correnti hanno le caratteristiche tipiche delle correnti attraverso i canali GIRK: l'attivazione di una proteina G agonista del recettore accoppiato (NE), la rettificazione verso l'interno, e il blocco delle correnti dai bloccante putativo canale GIRK, Ba ^{2 +} (B, traccia a destra rosso). Cerchi aperti e pieni rappresentano io _GIRK presso l'azienda e la corrente di picco, rispettivamente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Problemi comuni riscontrati e suggerimenti:

Come accennato in precedenza, le iniezioni di successo nucleare dipendono dall'avere cellule aderenti alle piastre di coltura dei tessuti. Posticipando l'inizio di iniezioni poche ore dopo la procedura cellula dissociazione permette ai neuroni di aderire al fondo dei piatti. In aggiunta, piatti rivestimento con 0,1 mg / ml di alto peso molecolare poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) adesione aiuti di neuroni alla superficie inferiore dei piatti.

Blocco di pipette microiniezione, soprattutto quando si cerca di iniettare una elevata concentrazione di DNA, può essere un problema frequente. Utilizzando alta qualità colonne di separazione per isolare e purificare DNA plasmidico, e di eseguire la procedura di purificazione addizionale citato (filtri spin, spinning in tubi di ematocrito) può contribuire a rimuovere le particelle prima di iniettarlo. Durante le iniezioni, la funzione "pulita" della pressione iniettore può essere utilizzato (per 0,2 s è sufficiente), ma se questo non risolve il problema, una pipetta nuova iniezione dovrebbe essere usato. Se la maggioranza di pipette microiniezione occludersi durante una sessione di iniezione, in considerazione modificando le impostazioni del estrattore pipetta di vetro per la produzione di puntali microiniezione con una maggiore apertura.

Un altro problema che si pone nel corso di iniezioni nucleare è l'irregolarità della superficie inferiore di piatti di coltura di tessuti. Questa variabilità influenza direttamente la precisione di mira puntali di iniezione al nucleo in quanto la profondità del attraversa pipetta durante le iniezioni è fisso. Pertanto, questo asse z limite deve essere regolato durante il ciclo di iniezioni all'interno della stesso piatto. Sarà evidente quando un adeguamento è necessario: non ci sarà alcuna indicazione di iniezione nucleare (nessun pennacchio bianco o nel nucleo della cellula è mancato del tutto), o la punta della pipetta di iniezione si avvicina al fondo del piatto (comprimendo la cellula o anche schiantarsi la punta della pipetta sul fondo del piatto). Vetro-clonazione cilindri (. OD 10 mm, Cat. No. 2090-01010, Bellco Vetro, Vineland, NJ) possono essere utilizzati durante la placcatura dei neuroni di limitare in un più piccolo, un'area più limitata, quindi riducendo al minimo la distanza necessaria per muoversi la pipetta di iniezione tra le iniezioni. Questi cilindri clonazione sono stati rimossi prima di eseguire microiniezioni.

Svantaggi della tecnica:

Microiniezioni intranucleari sono tecnicamente impegnativi, che richiedono pazienza e un alto grado di destrezza manuale da parte dell'operatore. Competenza con questa tecnica, come ogni altra abilità, viene con la pratica. Quindi, si consiglia di praticare iniezioni nucleare del gene reporter solo prima di tentare esperimenti reali. Per aiutare ulteriormente il processo di iniezione, può essere possibile consolidare i passi del micromanipolatore e la pressione di iniezione in un programma per computer. Programmi come Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) possono essere utilizzati per memorizzare le impostazioni microiniezione e programmare i controllori multifunzione (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) per semi-automatizzare il processo di iniezione (vedere 6,7,8 per i dettagli).
Un altro svantaggio della tecnica microiniezione intranucleari è la bassa percentuale di successo. Circa il 10-20% dei tentativi iniezioni nucleare portare ad espressione della proteina. Anche se questa efficienza può essere sufficiente per le applicazioni che non richiedono un gran numero di cellule che esprimono, elettrofisiologia ad esempio, per vari saggi biochimici questo potrebbe non essere sufficiente.

Le applicazioni della tecnica:

Nonostante i suoi svantaggi, microiniezione intranucleari del DNA è una tecnica estremamente utile per heterologously che esprimono proteine ​​nei neuroni.

Alti livelli di espressione della proteina si ottengono con microiniezioni nucleare a causa del gran numero di plasmidi rilasciato nel nucleo durante le iniezioni, un promotore molto attivo CMV, che regolano la trascrizione genica, e la stabilità a lungo di plasmidi nel nucleo. Proteine ​​sovra-espressione è particolarmente utile nelle dominante negativo esperimenti in cui sono richiesti alti livelli di proteine ​​eterologhe per sopraffare la proteina endogena. Un altro vantaggio di intranucleari iniezioni è la capacità di fornire una percentuale consistente di costrutti cDNA al nucleo quando costruisce più vengono iniettati. Con i metodi di transfezione altra parte, è difficile introdurre riproducibile la stessa proporzione di DNA ogni costrutto in cellule diverse all'interno dello stesso piatto e tra trasfezioni. Iniezione diretta di soluzione cDNA nel nucleo elimina questa fonte di variabilità e permette il rapporto tra proteine ​​espresse da essere titolati in modo efficace.

Metodi di trasfezione tradizionali hanno efficacia limitata nel post-mitotico delle cellule a causa della scarsa incorporazione di DNA nel nucleo ⁹ e tossicità chimica associata a REAG trasfezionegenitori ^10. Microiniezioni nucleare superare questi problemi attraverso l'introduzione di materiale genetico nel nucleo meccanicamente. Sebbene questa tecnica è più coinvolto, la possibilità di studiare l'effetto di una proteina in un sistema biologico funzionale, completo di endogeno vie di segnalazione, più che compensa la natura laboriosa di questa tecnica.

Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Linee guida per la cura degli animali e Usa.

Il nostro laboratorio di ricerca è sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on abuso di alcool e l'alcolismo.

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