Chick Ex ovo Kultur och Ex ovo CAM analysen: hur det verkligen fungerar

All utrustning och reagenser måste köpas steril eller behöver värme eller ånga steriliseras eller steriliseras med 70% EtOH.

Författarna hävdar att experiment på djur har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv (86/609/EEG) i enlighet med riktlinjerna av NIH angående skötsel och användning av djur för försöksändamål förfaranden och de regler som anges av Institutional Animal Skötsel och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Duisburg-Essen (Tyskland).

Del 1: Inkubation av ägg

1. Befruktade ägg kan förvaras vid 13 ° C i upp till en vecka.
2. Ägg inkuberas under 72 timmar, som ligger horisontellt i en kuvös med ett rörligt bricka, roterande äggen 12 gånger om dagen kontinuerligt. Luftfuktigheten hålls vid 60 - 62%, inkubation temperaturen på 37,5 ° C.
   Obs: Innan du börjar inkubation, smuts, fjädrar och avföring avlägsnas omsorgsfullt från äggskal mekaniskt av torr avtorkning med gemensamma, grått papper sicksack handdukar, som har en grov snarare än en mjuk ytstruktur. Torka av äggen med etanol eller desinfektionsmedel, dock betydligt minskad överlevnad av embryona, oberoende av använda vätskan.

Del 2: Ex ovo kultur

1. Efter inkubation i 72 timmar, är ägg som tas ur inkubatorn.
   Obs: ägg inkuberas i 72 timmar eftersom - enligt våra experiment - av okänd anledning, men i samförstånd med Auerbach et al.1 tidigare utvecklingsstadier hade signifikant lägre överlevnad. Vid steg senare än 72 timmar äggulan säck som ännu inte omfattas av CAM blir tunnare och tenderar att ansluta sig till äggskalet ledande (i) till små blödningar i området följsamhet och (ii) bristning av äggulan-säcken membran. Därför presenterade metoden inte är tillämplig på embryon är äldre än 72 timmar.
2. Den övre sidan av ägg, där embryot är bosatt, präglas av blyertspenna eftersom embryot emot rotationen till en viss grad.
3. Ägget hålls horisontellt med pennan märket på topp och sprucken i kanten av en 80 mm trekantig magnetisk omrörare om orienterade vinkelrätt mot den långa axeln av ägget.
   Notera: För en bättre känsla, ska inga handskar användas, men händerna ska desinficeras med 70% EtOH. Det är viktigt att äggskal samt ägg membran öppnas. Läckage av äggvita är ett säkert tecken på att ägget membranet har perforerad.
4. Ägget hålls nära botten av petriskålen att undvika ytterligare läckage av äggvita.
   Obs: Under den inledande öppningen förfarandet är det viktigt att äggvitan på botten av petriskålen fortfarande är ansluten till resten inne i ägget som detta resulterar i ett vakuum inuti ägget som håller äggulan med embryot ovanpå insidan ägget. Det vakuum kan regleras antingen genom tryck med fingret som kontrollerar insläpp av luft in i ägget eller genom att lyfta ägget som ökar kolumnen anslutna äggvita dvs vakuum.
5. Genom att försiktigt sätta press på meridianen som löper genom sprickan och ekvatorn i ägget med tummen och långfingret är det möjligt att reglera vakuum. Innehållet i ägget kan sedan överföras till petriskålen oskadad, om ägget med äggulan är försiktigt lyfts och båda halvorna av skalet är noggrant åtskilda. Embryot och äggulan fartyg bör ligga på toppen av ett oskadat äggula.
   Obs: Om penna markerar inte hålls på topp, kanske embryot skadas när sprickbildning skalet. Om äggen inte är spruckna noga nog eller embryona är äldre än 72 timmar (se ovan), pinnar äggulan säcken till skalet och ofta spricker. Samma sak händer när fuktighet inkubatorn är lägre än 60% eller ägg är inte roteras under inkubationstiden.
6. Ex ovo kulturer är tillbaka till en inkubator och förvaras pÃ¥ 37,5 ° 38,2 ° C och 60% luftfuktighet. CO ₂ eller O ₂ utbudet är inte nödvändigt om inkubatorn inte är stängd hermetiskt (ventilation galler delvis öppna!) Och speciella petriskÃ¥lar med distanser mellan lock och fat används.
   OBS: Flytta av de embryon bör hållas till ett minimum under de första dagarna av inkubationen. För mycket agitation leder till hög dödlighet. Från 9 inkubation dagen och framåt, embryona är mindre känsliga för agitation.
   Döda embryon bör tas bort omedelbart för att undvika infektioner.
   Om cellodling inkubatorer används, som är lufttätt förslutna, O ₂ tillgÃ¥ngen är obligatorisk för de embryon inte dö. Fukt är viktigt för CAM att inte torka ut och om inkubation temperaturen är lägre än 37 ° C, kommer embryona utvecklas för lÃ¥ngsamt.

Del 3: Tillämpning av ämnen för angiogenes analyser

1. Autoklaveras vikt filterpapper (50,5 mm i diameter) är stansade ett hålslaget och användas som underlag (bärare) för flytande ämnen tillämpas på CAM.
   Notera: Nästan alla bärarmaterial (se tabell nedan) orsakade irritation av CAM, särskilt när tillämpas före inkubering dag 10, eftersom det ändrade utveckla arkitektur CAM-fartyg. Detta även potentiellt inerta ämnen såsom hydroxietylcellulosa folie, Teflon svampar (PTFE-pledgets), kollagen svampar, kollagen folie, steril gasbinda (kompresser), runda täckglas, och ringar kisel, som alla orsakade falskt positiva resultat. Filterpapper verkade förorsakar minsta irritation och därför används i våra analyser.
2. När CAM är fullt utbyggt kan upp till sex olika prover skall tillämpas och deras effekter kan jämföras på en enda CAM.
3. För att undvika uttorkning filter ytterligare doser (3 mikrogram modersmål angiotropin) eller buffert (5 l PBS) bör appliceras varje dag.
4. Från dag 3 efter ansökan, blodkärl orientera mot angiogena ämnen på filtren, medan mönstret av blodkärlen som omger kontroller är oförändrad.
   Obs: CAM bör inte förväxlas med gulan-säcken. CAM är en dynamisk utveckling av struktur medan äggulan säcken är statisk med små variationer under utveckling. På att utveckla dag tre u-CAM kan redovisas för första gången vid den bakre änden av embryot som en liten vesikler. Mellan dag tre och dag tio den inledande vesikler expanderar och skapar ett vikt två lager membran igenväxning äggulan säcken i allt snabbare takt. Appliceringsstället bör halvvägs mellan embryot och veck i CAM (gränsen) som annars embryot hindrar mikroskopisk observation av effekter i genomlysning. Alternativt kan filtret med den angiogena ämnet internaliseras när CAM fortsätter att växa.

Del 4: Inokulering av celler på CAM

4.1.Preparation av celler

1. Sammanflytande celler överförs från kultur kolven till FALCON rören med hjälp av en steril 25 ml plastpipetten med hjälp av en pipett stöd.
2. För att uppskatta mobilnummer, är 15 l av cellsuspensionen överförs till ett Neubauer kammare och celler räknas manuellt i mikroskop.
3. Falcon rör centrifugeras i 3 min vid 1000 rpm vid rumstemperatur och supernatanten tas bort.
4. För levande cell tracking, celler spädas med PBS till önskad koncentration (här: 2x10 ⁷ celler / ml) och färgas med t.ex. PKH26 (Sigma), en röd fluorescerande levande cell membran märkning kit, enligt tillverkarens protokollet.
   Celler är resuspenderas i cellodling medium (företrädesvis Dulbecco ändrade örn medium; DMEM) till önskad koncentration för injektion (10 ⁷ celler / ml) eller inokulering (3x10 ⁶ celler / ml). Olika celler koncentrationer tillämpas för injektionsvätskor vs ympning enligt koncentrationerna redan publicerats i litteraturen ^15-17 och vÃ¥r erfarenhet.

4,2 Inokulering av celler på CAM

1. Ringar (~ 1 mm tjocklek) har skurits ut från en 1 ml pipettspets eller en perifer venkateter (PVL) röret med hjälp av en vass skalpell och tillämpas på webcam en E6-E14 odlade kycklingembryo ex ovo.
   Observera: Försök att inte "såg" flera gånger men att skära igenom pipettspetsen eller kateter slang med en skära med en ny, mycket skarp skalpell för att undvika skarpa kanter på den resulterande ringarna. Kolla ringarna under mikroskop för skarpa kanter till följd av mikrosprickor.
2. Beroende pÃ¥ storleken av ringarna 20 l 3x10 ⁶ celler / ml celler pipetteras totalt i en ring eller som delade volymer i flera ringar.
   Obs: I vissa fall traumatisering av CAM genom att försiktigt skrapa är en förutsättning, t ex för att underlätta ympning av celler ¹⁷ och kapillarisering av transplantat (se nedan). Om däremot traumatisering av CAM inte avsedda eller contraindicative, t.ex. för studier av invasiva potential tumörceller, bör ringarna inte användas för ympning, men celler bör tillämpas direkt som tillämpning av ringar eller ringar själva kan inducera mikro lesion . Om ringarna används bör dessa skäras sÃ¥ tunt som möjligt för att minimera vikt och undvika indrag av CAM.

Del 5: Intravitreala injektion av celler

1. En Hamilton mikroliter spruta sköljas flera gånger med 70% EtOH och slutligen med steril PBS.
2. Mikro sprutan är fylld med det färdiga färgade eller ofärgade cellsuspension (se del 4.1).
   Obs: injektionsstället måste noggrant utvalda, för att inte skada blodkärlen i CAM eller närliggande strukturer av embryot (brain!) med över penetrering med nålen. Injektionen ska ske under en dissektion kikare.
3. Under mikroskop kontrollFörsiktigt, men snabbt tränga in i CAM och lager ögat med nålen och kontinuerligt injicera 10 till maximal 20 l cellsuspension (företrädesvis spätts i PBS) i glaskroppen av odlade kycklingembryo ex ovo.
   Obs: Om CAM inte kan penetreras med nål, kan det tas bort på en plats med få eller inga blodkärl genom att försiktigt riva sönder den med två pincett.
4. Nålen bör vara 1-2 sekunder in i ögat för att undvika en förlust av det injicerade cellsuspension av läckage.

Del 6: dissekering av knoppar kyckling lem

1. Ägg är ur kuvösen efter 3 till 4 dagars inkubation (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
2. Ägg är spruckna i kanten av en trekantig magnetisk omrörare och överföras till en petriskål (detaljer: se del 2) och embryot dissekeras från den anslutna äggulan fartyg genom att klippa en cirkel med Spring sax.
3. Embryot överförs till en ny petriskål fylld med kallt, sterilt PBS med hjälp av ett litet avlopp sked och tvättade av typ agitation.
4. Embryot överförs till en liten petriskål fylld med steril PBS och fri från omgivande membran, försiktigt riva sönder dem med fin pincett.
5. Limb knoppar skiljs av mikrokirurgisk pincett så nära kroppen som möjligt, förstått och överförs till CAM av en 8-10-dagar gamla odlade värd kyckling ex ovo (se ympning förfarande).

Del 7: Förberedelse av knoppar mus lem

1. Tid gravid parningar sätts upp och på morgonen den dag då en vaginal plug upptäcks hos kvinnor parning är utsedd dräktighetens dag 0.
2. Den dräktiga offras av halsdislokation då utvecklingen av embryon nått embryonala dag (E) 10 till 13 och fixerade på en vax ombord.
3. Bukväggen är fuktad med 70% EtOH, skär längs mittlinjen och huden klaffarna är fasta sidled stift.
4. Både horn i livmodern tas bort från buken, fristående och överförs till en bägare med kallt PBS.
5. Embryona är separerade, överförs till en petriskål och livmoder väggen och embryonala membran avlägsnas försiktigt med hjälp av tång.
6. Limb knoppar är avskurna med hjälp av vårens sax eller loss av fina pincett så nära kroppen som möjligt, förstått och överförs till CAM 8-10-dagar gamla värd kyckling odlade ex ovo (se ympning förfarande).

Del 8: Insamling av tumörprover

1. Tumör biopsier samlas i 2 ml Eppendorf-rör fyllt med tumör-specifika odlingssubstrat (här: Leibovitz på medellång) och förvaras i rumstemperatur.
2. Tumör biopsier skärs i 1-2 mm3 stycken av sterila skalpeller.
   Obs: Om tumörprover var för små, kanske de inte fäster CAM, om de var för stora, kan CAM skadas och embryot skulle dö.
3. En bit från kärnan av biopsi provet ympas CAM 8-10-dagar gamla värd kyckling odlade ex ovo (se ympning förfarande).
   Anm: Med material från ytan av biopsi ökar risken för kontaminering med muskler och bindväv.

Del 9: Ympning förfarande

1. För ympning av lem knoppar eller tumör exemplar, den fullt utvecklade CAM 8-10-dagar gamla kycklingembryon odlade ex ovo används.
2. Transplantaten är idealiskt beläget på CAM nära en Y bifurkation av ett blodkärl.
3. Vid önskad applikationsstället är CAM selektivt traumatiserade genom försiktig skrapning av (tång) den övre peridermal delen av dubbla epiteliala skiktet medan den basala lagret intakt.
   OBS: Det är viktigt att undvika blödning eller synlig ruptur av kapillärer.
4. Transplantatet överförs till CAM med minimal PBS bifogas. Beroende på transplantat, kan det placeras en eller två gånger på en plats i CAM, där ingen slutlig ympning är avsett att undanröja orimliga PBS och slutligen ympade på traumatiserade beredd CAM-sajt.
5. Transplantatet är fattade av fina pincett och lager på CAM. Beroende på känsligheten i transplantat kan lätt tryck appliceras (inte lämplig för lem knoppar) för att manövrera ympa in en resulterande indrag för CAM (lämplig för tumörprover).
   OBS: Eftersom chick immunsystemet utvecklas i embryonala dag (E) 18, ska ex ovo xenografter kulturer inte förlängas längre än E17 som värd kycklingembryon ofta dör.
   Det är viktigt att ha tillgång värd dygnet runt, respektive kycklingembryon odlade ex ovo, tidsinställda att sammanfalla med en källa av givare vävnad som du väljer.

Del 10: Re-ympning

1. Värden kycklingembryo dödas genom halshuggning.
2. CAM medbifogade transplantatet avlägsnas genom ett cirkulärt snitt med spetsiga sax och överförs till en petriskål fylld med PBS.
3. Överdriven CAM är klippt från transplantatet till våren sax undantag för fd applikationsstället.
4. I händelse av större tumörprover är transplantat skär i halvor eller flera mindre delar och åter ympas med skäreggen vänd mot nya webcam i den andra värden.

Del 11: representativa resultat

Figur 1. Shell-mindre kyckling kultur
Kyckling embryon i olika utvecklingsstadier odlade ex ovo i petriskålar.

Figur 2. Ex ovo CAM angiogenes analys
Befruktade hönsägg inkuberades horisontellt vid 37 ° C och luftfuktighet på 60 - 62% och sprucken i petriskålar på embryonala dag 4 (E4). Inkubering fortsatte på samma villkor. På E10 sterila filterpapper (5,5 mm i diameter) var lager på toppen av CAM och dränkta med antingen 5 l PBS eller 3 mikrogram infödda angiotropin6. Kapillärer visade tydligt anpassning till de angiotropin indränkt filterpapper på E14.

Figur 3. Ex ovo ympning av lem knoppar
Limb knoppar från chick (E3/E4) och mus (E13) har ympats på CAM skal mindre kyckling kulturer. Blodkärl från CAM in extremiteten knopparna efter två dagar. Utvecklingen av lem knoppar fortsatte i dessa ex ovo kulturer nådde en två fingerben skede i brud och visa minskning av interdigitala duk i murina lem knoppar.

Figur 4. Ex ovo ympning av tumör prov
En biopsi prov av urinblåsan karcinom var inympas på CAM av en 10-dagar gamla odlade kycklingembryo ex ovo. Efter två dagar i kultur, var tumören exemplar ansluten till CAM-kärlsystemet och efter 7 dagar, fanns flera blodkärl in i transplantatet observerats.

Innovativ eller bara en annan brud kultur-protokollet?

Med tidigare skal mindre kultur protokollen ^1-4 den totala överlevnaden av kycklingembryon var lÃ¥ga, t ex ca. 30% ^1. Den raffinerade ex ovo kultur protokoll som beskrivs i denna video artikeln, däremot möjliggör överlevnad över 50%. Jämfört med klassisk ovo kulturer ex ovo kultur kycklingembryon underlättar avsevärt tillgänglighet CAM och kycklingembryo och gör sin experimentella manipulation och kontinuerlig uppföljning. Denna kultur metod kan användas för en mängd olika program som sträcker sig frÃ¥n ökad angiogenes analyser ^5,6, att underlättas injektioner i glaskroppen för kycklingembryo ögat ^7-9, intravasation analyser ^10-12, förbättrad ympning och tillväxt lem knoppar ¹³ och innovativa underhÃ¥ll av tumörprover ^14. Därmed bidrar ex ovo kulturen ett användbart verktyg i utvecklings-, angionesis och tumör forskning.