Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

1. Hefestämme

Stämme mit Wildtyp-SGS1 TOP3 (WT; W303-1A, Genotyp, MAT ein ade2-1 CANL-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRPL-l ura3-1) [2], ein sgs1 Mutante (W1292-3C ; Genotyp MAT ein SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) und eine sgs1 Top3-Mutante (W1058-11C, Genotyp, MAT ein SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 Top3-2:: HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) wurden [3] aus und wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Rodney Rothstein (Columbia University).

2. Plasmid-DNA-Konstruktionen

Die WRN-Gen wurde in YEp112SpGAL nach dem Schema wie bereits geklont.

1. Site-directed Mutationen WRN (E84A Exonuklease tot, K577M Helikase tot, R834C und K1016A) in das Plasmid YEp195SpGAL-WRN [4] wurden unter Verwendung mutagener Primer und ein Standard-Protokoll von Quickchange II XL Mutagenese-Kit (Stratagene) von Lofstrand Labors (Gaithersburg, MD).
2. DNA-Fragmente WRN und die damit verbundenen Varianten wurden Gel aus dem jeweiligen YEp195SpGAL-WRN Konstrukte nach Doppel-Verdau mit Sal I und Mlu I. gereinigt
3. Gel gereinigten Fragmente wurden dann in die Sal I MluI Stellen des Vektors YEp112SpGAL, eine 2 um multi-copy Plasmid mit einem Selektionsmarker TRP1 zu YEp112SpGAL WRN oder WRN Varianten unter der Kontrolle eines gal-induzierbaren Promotor-Konstrukt, wie in Abbildung 1 dargestellt geklont .
4. Die Konstrukte so erhalten wurden, als YEp112SpGAL-WRN, YEp112SpGAL-WRN E84A, YEp112SpGAL-WRN K577M, YEp112SpGAL-WRN K1016A und YEp112SpGAL-WRN R834C benannt.

3. Transformation

Hefekulturen angebaut wurden unter Verwendung von Standard-Protokoll und Transformationen wurden mit einem Lithium-Acetat-basiertes Protokoll von Gietz et al [5]. Kurz gesagt, wurden die folgenden Schritte durchgeführt.

1. Kulturen der oben genannten Stämme wurden über Nacht in 5 ml YPD (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose) gezüchtet. Die Kulturen wurden in 50 ml YPD-Medium überimpft und durften bis zu einer OD ₆₀₀ von 1,0 wachsen - 1,2 erreicht wurde.
2. Die Kulturen wurden geerntet, gewaschen mit 20 ml Wasser, und in 1 ml 100 mM Lithium-Acetat (LiAc). Die Zellen wurden bei 30 ° C für 10 min inkubiert.
3. Zellpellet wurde in 100 mM LiAc auf ein Endvolumen von 500 ul, die genug zu zehn Transformationen zu tun ist, resuspendiert. 50 ul der Zellsuspension wurde aliquotiert und Zellpellet wurde durch Zentrifugation gesammelt.
4. 250 ul 50% Polyethylenglykol (PEG), 36 ul 1 M LiAc, 25 ul von 2 mg / ml ssDNA (Lachssperma-DNA), 5 ml von Plasmid-DNA (100 ng: Um das Zellpellet wurde in der folgenden Reihenfolge aufgenommen 1000 ng), und 50 ul Wasser. Zellpellet wurde für 1 min gevortext.
5. Die Zellen wurden dann bei 30 ° C für 30 min durch einen Hitzeschock bei 42 ° C gefolgt von 20 min.
6. Die Zellen wurden geerntet und in 1 ml Wasser. Da das Plasmid YEp112SpGAL enthält trp als Selektionsmarker, würden alle Mutanten beherbergen das Konstrukt werden trp beherrschen. Daher wurden Transformanten durch Ausplattieren der Suspension auf SC (Synthetic komplett) Glukose Medien fehlt Trp und Inkubation der Platten bei 30 ausgewählten ° C für 3-4 Tage, bis die Kolonien erscheinen.

4. Genetische Analyse des langsamen Wachstums Phänotyp Restaurierung in WRN verwandelt sgs1 Top3 Belastung.

1. Streak-Analyse:

1. Um die Wirkung der WRN Ausdruck auf das Wachstum von Wildtyp-Eltern (W303-1A), sgs1 oder sgs1 Top3-Stämme, die entsprechenden Stämme mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL-WRN wurden auf SC minus Trp-Platten mit entweder 2% Glukose Streifen zu untersuchen ( glu) oder 2% Galactose (gal). Als Kontrolle wurde sgs1 Top3 / YEp112SpGAL-SGS1 enthalten. Die Platten wurden bei 30 ° C für 2 Tage inkubiert.
2. Zur Bestimmung der Fähigkeit von WRN zur Zuwachsrate des sgs1 Top3 Belastung bei niedrigeren WRN-Protein Expression beeinflussen, die sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN transformiert oder YEp112SpGAL-SGS1 wurde auf SC minus Trp-Platten ausgestrichen, die variierende Konzentrationen von gal aus so niedrig wie 0,005% so hoch wie 2%. Die Platten wurden dann bei 30 ° C für 2 Tage inkubiert.
3. Zur Beurteilung der funktionalen Anforderungen an WRN des langsamen Wachstums Phänotyp in der sgs1 Top3 Hintergrund wiederherzustellen, sgs1 Top3 mit YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C und K1016A) umgewandelt wurden streAked auf SC minus Trp-Platten, die entweder glu oder gal in den angegebenen Konzentrationen. Für Kontrollen war sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN oder YEp112Sp GAL-SGS1 verwandelt enthalten. Die Platten wurden dann bei 30 ° C für 2 Tage inkubiert.

2. Flüssige Kultur-Analyse:

1. Zur Beurteilung des Wachstums von transformierten sgs1 Top3-Stämme in Flüssigkultur wurden Hefezellen in SC raf minus Trp bei 30 ° C über Nacht gewachsen. Die Kulturen wurden in SC raf minus Trp überimpft und bei 30 ° C bis Anfang Log-Phase (OD ₆₀₀ von ~ 0,5). Die Kulturen wurden dann bei OD _0,05 in SC Medien mit 2% gal und Wachstum überimpft wurde durch Messung der Absorption bei den angegebenen Zeitintervallen folgen.

5. Genetische Analyse von Hydroxyurea oder methylmethane-sulfonat Empfindlichkeit in WRN transformierten Hefestämme.

1. Zur Bestimmung der Wirkung von WRN Ausdruck auf dem MMS-und HU-Empfindlichkeit von sgs1 oder sgs1 Top3-Stämme, Stämme mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL-WRN verwandelt wurden in SC raf minus Trp bei 30 ° C.
2. Die Kulturen wurden in SC raf minus Trp überimpft und bei 30 ° C bis Anfang Log-Phase (OD ₆₀₀ von ca. 0,6 bis 0,8).
3. Zehn-fache serielle Verdünnungen dieser Stämme wurden unter Verwendung von SC Medium ohne Trp. Von einer exponentiell wachsenden Kultur wurden 5 x 10 ⁶ Zellen aufgenommen und seriell bis zu 10.000-fach verdünnt. Vier Mikroliter jeder Verdünnung wurde auf SC gal minus Trp-Platten mit den angegebenen Konzentrationen von HU oder MMS gesichtet. Die Platten wurden bei 30 ° C inkubiert
4. Als Kontrolle Wildtyp elterlichen Stamm (W303-1A) mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL-WRN oder sgs1 Top3 / YEp112SpGAL-SGS1 umgewandelt wurde wie oben beschrieben behandelt.

6. Zellzyklus-Verteilung der WRN verwandelt sgs1 Top3 Belastung.

1. Zur Untersuchung der Zellzyklus-Verteilung der WRN verwandelt sgs1 Top3-Stamm, Kulturen sgs1 Top3 mit YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN oder YEp112SpGAL-SGS1 verwandelt, und der Vektor-transformierten Wildtyp elterlichen Stamm (W303-1A) wurden in SC raf gewachsen minus trp bei 30 ° C über Nacht.
2. Kulturen bei OD _0,05 wurden überimpft und dürfen til frühen Log-Phase (OD ₆₀₀ von 0,5 -0,6) wachsen. WRN-Expression wurde durch Zugabe von gal bis 2% Endkonzentration induziert. Die Kulturen wurden dann bei 30 ° C wachsen für 6 h
3. Die Kulturen wurden dann für DAPI (4 ', 6-Diamino-2-phenylindole) Färbung verarbeitet.
   1. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation bei 5800 xg für 10 min bei Raumtemperatur (RT) geerntet.
   2. Die Zellen wurden einmal mit gewaschen 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und wurden dann in 70% Ethanol für 20 min bei RT fixiert.
   3. Fixierten Zellen wurden zweimal mit 1 X PBS gewaschen und schließlich in 1X PBS resuspendiert.
4. Die Zellen wurden auf Objektträger gebracht und montiert in Vectashield Eindeckmedium mit DAPI (1 pg / ml) (Vector, USA). Und Composite-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC); Die Zellen wurden mit einem Axiovert 200 M Mikroskop (100x-Objektiv Zeiss) untersucht. Fluoreszenzbilder wurden mit AxioVision, Version 3.0-Programm (Zeiss).

7. Western-Blot-Analysen.

1. Zur Bestimmung der Proteinexpression von WRN oder die WRN Varianten in transformierten sgs1 oder sgs1 Top3-Stämme wurden Lysate nach der folgenden Methode und Proteine, die durch immunblotting analysiert vorbereitet.

1. Transformierte sgs1 oder sgs1 Top3-Stämme wurden in SC raf minus Trp bei 30 ° C über Nacht.
2. Die Kulturen wurden überimpft und bei 30 ° C bis in die frühen Log-Phase (OD ₆₀₀ von 0,5 bis 0,8) und dann induziert, indem gal bis 2% Endkonzentration. Die Kulturen wurden dann bei 30 ° C wachsen für 6 h
3. Cells (3 ml) wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit PBS gewaschen. Zellpellet wurde in alkalischen Lyse-Puffer [50 mM NaOH, pH 10,5, 2 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol und Proteaseinhibitoren (Roche Molecular Biochemicals)] , für 5 min gekocht, durch Zentrifugieren geklärt, und neutralisiert mit 1 M HCl.
4. Proteine ​​aus äquivalenten Mengen von Zelllysat wurden auf 8-16% Polyacrylamid-SDS-Gele aufgelöst.

2. Zur Bestimmung der Höhe der Expression des WRN-Protein unter dem Einfluss von unterschiedlichen Konzentrationen von Galaktose, wurden die Kulturen wie folgt verarbeitet.

1. Transformierte sgs1 Top3-Stämme wurden in SC raf minus Trp bei 30 ° C über Nacht gewachsen.
2. Die Kulturen wurden überimpft und bei 30 ° C bis in die frühen Log-Phase (OD ₆₀₀ von 0,5 bis 0,8) und dann induziert, indem gal bis 2% Endkonzentration. Die Kulturen wurden dann bei 30 ° C wachsen für 6 h
3. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1% Natriumdeoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdodecylsulfat [SDS]), die Protease-Inhibitoren (0,05% PMSF, 0,05 pg / ml Leupeptin).
4. Glasperlen (425 bis 600 um) wurden zu dem Gemisch zugegeben, und die Zellen wurden durch Vortexen gebrochen.
5. Die daraus resultierende Homogenat wurde für 5 min bei 15000 xg zentrifugiert und der Überstand-Fraktion wurde gesammelt.
6. Protein im Lysat Fraktionen wurde mittels Bradford-Methode geschätzt.
7. Equal Konzentration des Proteins aus verschiedenen Fraktionen Lysat wurde auf 8-16% Polyacrylamid-SDS-Gele aufgelöst.

3. Expression von WRN oder WRN mutierten Proteine ​​wurde durch Western-Blot mit einem WRN monoklonalen Maus-Antikörper gegen ein Epitop in einer gereinigten C-terminale Fragment von WRN gerichtet bestimmt [6] (1:1000, Spring Valley Labs).

4. Primäre Antikörper-Inkubation wurde durch Inkubation mit einem sekundären (Meerrettich-Peroxidase-konjugiert) Antikörper (1:5000) gefolgt. Blots wurden mit einem ECL Plus westlichen Detection System pro Protokoll des Herstellers verarbeitet.

5. Für die quantitative Western-Blot-Analyse, steigenden Konzentrationen von rekombinantem His-Tag in voller Länge WRN-Protein auf Gelen, so dass bei Quantifizierung der Blot eine Standard-lineare Kurve erzeugt werden könnten enthalten waren. Weiterhin wurden Zellextrakt aus äquivalente Menge an Zellen oder 20 ug der Hefe Lysatproben auf Gele geladen, um die Konzentration von WRN schätzen.

6. ImageQuant Analyse wurde dann auf Gelen und Standard-lineare Kurve durchgeführt wurde generiert.

7. Die Konzentration der WRN-Protein in unterschiedlichen Konzentrationen gal wurde mittels Standard-lineare Kurve generiert oben.

8. Repräsentative Ergebnisse

Alle Stämme in dieser Studie verwendet werden Trp Auxotrophen. Daher sgs1, sgs1 Top3 und Wildtyp W303-1A-Stämme mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL-WRN verwandelt wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, in Anwesenheit von SC minus Trp Medien wachsen ausgewählt. Zur Untersuchung der Wirkung von WRN Ausdruck auf das Wachstum von transformierten sgs1 Top3 mutierten Zellen wurden die Kulturen auf Platten mit SC minus Trp Medien mit 2% gal zu WRN Expression zu induzieren, ausgestrichen. Top3 decatenates verflochten DNA-Moleküle durch Sgs1 Helikase während der Replikation [1, 2] erzeugt, also in der Abwesenheit von Top3, Torsionsspannung wird nicht entlastet was zu langsamen Wachstum und hyper-Rekombination. Die genetische Funktion des sgs1 ist das langsame Wachstum Phänotyp einer Top3-Mutanten zu unterdrücken. Wenn WRN könnte SGS1 in genetische Interaktion Ersatz mit Top3 wäre Wiederherstellung der Top3 langsamen Wachstums Phänotyp in sgs1 Top3 zu erwarten.

Wie in Abbildung 2A gezeigt, verwandelte die WRN sgs1 Top3-Stamm wuchs deutlich langsamer, um den Vektor im Vergleich verwandelt sgs1 Top3 Belastung. Sgs1 Top3 transformiert mit dem YEp112SpGAL-SGS1 Plasmid wurde als positive Kontrolle (Abbildung 2A) enthalten, die zeigen, dass Wildtyp- Sgs1 in der sgs1 Top3-Mutante exprimiert konnte genetisch ergänzen das Wachstum Phänotyp. Die transformierten sgs1 Top3-Stämme wuchsen ebenfalls in der Abwesenheit von gal als für 2 Tage (Abbildung 2A) gezeigt. Expression von WRN hatte keinen Effekt auf das Wachstum der elterlichen Wildtyp (W3031A) oder sgs1 Stämme (Abbildung 2B), was darauf hinweist, dass die Wirkung von WRN auf das Zellwachstum bestimmte, dass in der sgs1 Top3 mutierten Hintergrund beobachtet wurde. Genetische Studien durchgeführt mit WRN Varianten gezeigt, dass WRN-Helikase, aber nicht Exonukleaseaktivität für die Wiederherstellung der Top3 Wachstumsphänotyp (Abbildung 3B) erforderlich war. Ein natürlich vorkommendes Missense-Polymorphismus in WRN, die mit Helicase-Aktivität stört abgeschafft seine Fähigkeit, Top3 langsamen Wachstums Phänotyp wiederherzustellen.

Top3 Mutanten sind in den späten S/G2 Phase des Zellzyklus verzögert [1], eine Eigenschaft, die für ihre langsamen Wachstums ausmachen kann. Die Mutation des Gens SGS1 in den Top3 Hintergrund unterdrückt die Verzögerung in der S/G2 Phase des Zellzyklus. Wenn WRN Ausdruck der Verzögerung bei der S/G2 Phase des Zellzyklus in sgs1 Top3 wiederherstellen könnte, würde eine erhöhte Population von großen Knospen Zellen mit ungeteilten Kerne für sgs1 Top3 mutierte Zellen, die WRN erwarten. Wie in Abbildung 4 dargestellt, lag der Anteil der großen Knospen Zellen höher sgs1 Top3 / WRN als sgs1 Top3 / Vektor, was auf die Wiederherstellung der S/G2 de Laien charakteristisch Top3.

Die sgs1 Top3 Doppelmutante ist weniger anfällig für MMS oder HU als die Top3 einzigen mutierten [2]. Da WRN betroffen Zellwachstum sgs1 Top3, wir als nächstes untersucht seine Auswirkungen auf die Empfindlichkeit, um methylmethane Sulfonat (MMS, ein Alkylierungsmittel) und Hydroxyurea (HU, ein Replikations-Inhibitor). Sgs1 Top3 / WRN angezeigt Empfindlichkeit, um sowohl die Drogen vergleichbar sgs1 Top3 / SGS1 (Abbildung 5). Genetische Analyse der WRN Varianten ergab, dass WRN Helikase / ATPase, aber nicht WRN Exonukleaseaktivität, die für ihre Wirkung auf die Empfindlichkeit gegenüber MMS und HU erforderlich war.

Abbildung 1. Schematische Darstellung zur Klonierung von WRN / WRN Varianten in YEp112SpGAL Vektor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der Abbildung 1.

Abbildung 2. WRN Ausdruck in sgs1 Top3 wieder das langsame Wachstum Phänotyp der Top3. Panel A, sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL WRN verwandelt auf einer SC-Trp-Platte mit entweder 2% oder 2% glu gal wurden ausgestrichen. Als eine Kontrolle sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL SGS1 verwandelt wurde auf beiden Platten ausgestrichen. Die Platten wurden bei 30 ° C für 2 Tage inkubiert und anschließend fotografiert. Panel B, Wild-Typ parentalen Stamm W303-1A oder sgs1 Stamm mit YEp112SpGAL oder YEp112SpGAL WRN verwandelt wurden auf einem SC-Trp Platte entweder mit 2% glu oder 2% gal gestreift . Die Platten wurden bei 30 ° C für 4 Tage inkubiert und anschließend fotografiert. Zusammensetzung der Platten wurde wie in Panel A und Panel B ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Abbildung 3. WRN ATPase / Helikase, aber nicht Exonukleaseaktivität, ist erforderlich, um das langsame Wachstum Phänotyp der Top3 in sgs1 Top3 Hintergrund wiederherstellen. Sgs1 Top3-Stamm mit ATPase / Helikase-dead (YEp195SpGAL WRN K577M) umgewandelt, Exonuklease-dead (YEp195SpGAL- WRN E84A) wurde RQC Mutante (YEp195SpGAL-WRN K1016A) oder polymorph-Mutante (YEp195SpGAL-WRN R834C) auf SC-Trp-Platten mit entweder 2% glu (Panel C) oder 2% gal (Panel B) ausgestrichen. Die Platten wurden bei 30 ° C für 2 Tage inkubiert und anschließend fotografiert. Zusammensetzung der Platten wurde wie in Systemsteuerung A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 3 zu sehen.

Abbildung 4. WRN Expression induziert S/G2 Verhaftung in sgs1 Top3-Zellen. Logarithmisch wachsenden Kulturen der sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN oder YEp112SpGAL SGS1 verwandelt, und der Vektor-transformierten Wildtyp elterlichen Stammes wurden bei 2% gal Konzentration induzierte für 6 h Die Kulturen wurden geerntet, verarbeitet für DAPI-Färbung wie in Materialien und Methoden beschrieben und beobachtet mit Axiovert 200 M Mikroskop (Zeiss, 100x-Objektiv). Dargestellt ist die DAPI-Färbung der sgs1 Top3 mit YEp112SpGAL (oben links) umgewandelt und mit YEp112SpGAL WRN (oben rechts). Die Pfeile zeigen Zellen mit ungeteilten Kerne. Verteilung der Zellen in G1 (Einzelzellen) und S/G2 (Knospen-Zellen) ist im unteren Bereich, dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

Abbildung 5. Wirkung von WRN Ausdruck auf der MMS-und HU-Empfindlichkeit von sgs1 Top3 Belastung. Logarithmisch wachsenden Kulturen der sgs1 Top3-Stamm mit YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, Exonuklease-dead (YEp112SpGAL-WRN E84A), ATPase / Helikase-dead (YEp112SpGAL WRN K577M), verwandelt RQC Mutante (YEp112SpGAL-WRN K1016A), polymorphe Mutante (YEp112SpGAL-WRN R834C), verwandelt YEp112SpGAL SGS1-und Vektor-Wildtyp elterlichen Stämme wurden in einem Zehn-fache serielle Verdünnungen auf SC-Trp-Platten mit glu oder gal und entweder MMS oder HU entdeckt in den angegebenen Konzentrationen. Die Platten wurden bei 30 ° C für 2 Tage (Kontrolle Platten) und 4 Tage (MMS-und HU-Platten) und dann fotografiert inkubiert. Bitte9/1639fig5.jpg "> Klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 5 zu sehen.

Eine der Stärken der Verwendung von Hefe als Modellsystem ist die Verfügbarkeit von Mutanten in definierten DNA-Replikation und-Reparatur-Reaktionswege, die zwischen Hefe und Mensch konserviert sind. Weitere Auswahl von Transformanten, die bestimmte Gene ist einfach und zuverlässig wie die Laborstämme auxotrophen Mutanten und Vektoren mit auxotrophen Marker sind leicht verfügbar sind. Mit Hilfe dieser Vektoren die Expression von Genprodukten kann, indem man sie unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (zB gal induzierbaren Promotor, etc.) geregelt werden. Angesichts dieser Vorteile haben wir ein Hefe basiert Modellsystem, um die funktionalen Anforderungen des menschlichen WRN Gen defekt in Werner-Syndrom in eine Bahn, die möglicherweise zwischen Mensch und Hefe konserviert zu studieren. Mit dem beschriebenen Ansätze, sofern wir die ersten Anzeichen dafür, dass WRN kann in einer genetischen Weg, der Top3-bezogene Phänotypen beeinflusst Funktion. Unsere Beobachtungen geben Anlass für weitere Untersuchung der Möglichkeit, dass WRN funktionell interagiert mit Top3α in menschlichen Zellen während der zellulären DNA-Replikation oder Rekombination. Es ist denkbar, in einer BLM-verschlechtertem Zustand kann WRN teilweise BLM Ersatz durch seine Protein Partnerschaft mit einem Topoisomerase.