Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

1. Las cepas de levadura

Las cepas de tipo salvaje SGS1 TOP3 (WT; W303-1A, el genotipo, MAT un ade2-1 CanL-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 DUAL-l ura3-1) [2], un mutante sgs1 (W1292-3C ; genotipo MAT un SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) y un sgs1 top3 mutante (W1058-11C, el genotipo, el MAT un SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 top3-2:: HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) se han caracterizado [3] y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Rodney Rothstein (Columbia University).

2. Construcciones de ADN plásmido

El gen fue clonado en WRN YEp112SpGAL siguiendo el esquema de como se discute.

1. Específica de sitio mutaciones de WRN (exonucleasa E84A muertos, K577M helicasa muertos, R834C, y K1016A) en el plásmido YEp195SpGAL-WRN [4] se construyeron utilizando primers mutagénicos y un protocolo estándar de QuickChange II XL kit de mutagénesis dirigida (Stratagene) por los laboratorios Lofstrand (Gaithersburg, MD).
2. Fragmentos de ADN que codifica WRN y sus variantes asociadas se purificaron en gel a partir de los respectivos YEp195SpGAL-WRN construye después de la digestión doble con Sal I y I. Mlu
3. Gel fragmentos purificados fueron clonados en el Sal sitios que Mlu I del vector YEp112SpGAL, a 2 m de múltiples copias del plásmido que contiene un marcador seleccionable para la construcción de trp1 YEp112SpGAL WRN o variantes WRN bajo el control de un promotor inducible por galón, como se muestra en la Figura 1 .
4. Las construcciones así obtenidos fueron nombrados como YEp112SpGAL-ABN, E84A YEp112SpGAL-ABN, K577M YEp112SpGAL-ABN, K1016A YEp112SpGAL-ABN, y R834C YEp112SpGAL-AVS.

3. Transformación

Cultivos de levaduras se cultivaron usando el protocolo estándar y las transformaciones se realizaron utilizando una base de acetato de litio protocolo por Gietz et al [5]. En pocas palabras, los pasos siguientes se llevaron a cabo.

1. Los cultivos de las cepas antes mencionadas se cultivaron durante la noche en 5 ml de YPD (extracto de levadura-peptona-dextrosa) medio. Los cultivos se inoculó en 50 ml de medio YPD y se deja crecer hasta una OD ₆₀₀ de 1,0 a 1,2 se alcanzó.
2. Los cultivos se cosechan, se lava con 20 ml de agua, y se resuspendió en 1 ml de 100 mM de acetato de litio (LiAc). Las células fueron incubadas a 30 ° C durante 10 min.
3. Sedimento celular se resuspendió en LiAc 100 mM en un volumen final de 500 l, que es suficiente para hacer diez transformaciones. 50 l de la suspensión celular se alícuota y pellet de células se recogieron por centrifugación.
4. Para el pellet de células se agregan en el orden siguiente: 250 l 50% de glicol polietileno (PEG), 36 l de 1 M LiAc, 25 l de 2 mg / ml ssDNA (ADN de esperma de salmón), 5 ml de ADN de plásmido (100 ng 1000 ng), y 50 l de agua. Pellet de células se agitaron durante 1 min.
5. Las células fueron incubadas a 30 ° C durante 30 minutos seguido de un choque térmico a 42 ° C durante 20 min.
6. Se recogieron las células y se resuspendieron en 1 ml de agua. Dado que el plásmido contiene YEp112SpGAL PRT como un marcador de selección, todas las cepas mutantes albergar la construcción se trp competente. Por lo tanto, se seleccionaron los transformantes en placas de la suspensión en el SC (sintético completo) los medios de comunicación carecen de glucosa Trp e incubando las placas a 30 ° C durante 3-4 días hasta que las colonias aparecen.

4. El análisis genético de la restauración del crecimiento fenotipo lento en WRN transformado sgs1 top3 cepa.

1. Racha de análisis:

1. Para examinar el efecto de la expresión WRN en el crecimiento de los padres de tipo salvaje (W303-1A), sgs1 o sgs1 top3 cepas, las cepas correspondientes a YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN-fueron sembradas en placas SC menos Trp que contienen glucosa al 2% ( glu) o 2% de galactosa (gal). Como control, sgs1 top3 / YEp112SpGAL SGS1-fue incluido. Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 2 días.
2. Para determinar la capacidad de AVS para afectar la tasa de crecimiento de la cepa sgs1 top3 a menores niveles de expresión de la proteína WRN, el sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-ABN, o YEp112SpGAL-SGS1 se sembró en placas SC menos Trp que contienen diferentes concentraciones de galones de tan bajas como 0,005% hasta un máximo de 2%. Las placas fueron incubadas a 30 º C durante 2 días.
3. Para evaluar las necesidades funcionales de AVS para restaurar el fenotipo de crecimiento lento en el sgs1 top3 de fondo, sgs1 top3 transformado con YEp112SpGAL-AVS (E84A, K577M, R834C, y K1016A) se streAked en placas SC menos Trp que contienen glucosa o el galón en las concentraciones indicadas. Para los controles, sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN o YEp112Sp GAL-SGS1 se incluyó. Las placas fueron incubadas a 30 º C durante 2 días.

2. Análisis de cultivo líquido:

1. Para evaluar el crecimiento de la transformada sgs1 top3 cepas en cultivo líquido, las células de levadura se cultivaron en SC raf Trp menos a 30 ° C durante la noche. Los cultivos se inoculó en SC raf menos Trp y crecido a 30 ° C para la fase de registro temprano (OD ₆₀₀ de ~ 0,5). Los cultivos se inoculó entonces en OD _0.05 en los medios de SC que contiene 2% gal y el crecimiento se siguió midiendo la absorbancia a intervalos de tiempo indicados.

5. El análisis genético de la hidroxiurea o methylmethane-sulfonato de sensibilidad en WRN transformado las cepas de levadura.

1. Para determinar el efecto de la expresión de la sensibilidad WRN MMS y HU de sgs1 o sgs1 top3 cepas, cepas transformadas con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN-se cultivaron en SC raf Trp menos a 30 ° C.
2. Los cultivos se inoculó en SC raf menos Trp y crecido a 30 ° C para la fase de registro temprano (OD ₆₀₀ de ~ 0,6 a 0,8).
3. Diez veces diluciones seriadas de estas cepas se prepararon utilizando SC medio que carecen de Trp. De una cultura de crecimiento exponencial, 5 x 10 ⁶ células fueron tomadas y se diluye en serie de hasta 10.000 veces. Cuatro microlitros de cada dilución fue descubierto en SC placas gal menos Trp que contiene las concentraciones indicadas de HU o MMS. Las placas fueron incubadas a 30 ° C.
4. Como control, de tipo salvaje cepa parental (W303-1A) o transformada con YEp112SpGAL YEp112SpGAL-ABN, o sgs1 top3 / YEp112SpGAL SGS1-fue tratada como se describe anteriormente.

6. Distribución del ciclo celular de WRN transformado sgs1 top3 cepa.

1. Para estudiar la distribución del ciclo celular de WRN transformado sgs1 top3 cepa, los cultivos de sgs1 top3 transformado con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN, o YEp112SpGAL SGS1-, y el vector transformado de tipo salvaje cepa parental (W303-1A) se cultivaron en SC raf trp menos a 30 ° C por la noche.
2. Los cultivos se inoculó en OD _0.05 y se deja crecer hasta que la fase de registro temprano (OD ₆₀₀ de 0,5 -0,6). WRN expresión fue inducida mediante la adición de galones al 2% de concentración final. Culturas se permitió a crecer a 30 ° C durante 6 h.
3. Los cultivos fueron procesadas para DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) tinción.
   1. Los cultivos fueron cosechadas por centrifugación a 5800 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA).
   2. Las células se lavaron una vez con 1X tampón fosfato salino (PBS) y fueron fijadas en etanol al 70% durante 20 min a temperatura ambiente.
   3. Las células fijadas se lavaron dos veces con una X PBS, y finalmente resuspendido en PBS 1X.
4. Las células se colocan en la diapositiva y montadas en Vectashield medio de montaje con DAPI (1 mg / ml) (Vector, EE.UU.). Las células fueron examinados con un microscopio M Axiovert 200 (Zeiss, lente de 100x) y el contraste de compuestos de interferencia diferencial (DIC). Imágenes de fluorescencia fueron analizados utilizando AxioVision, la versión 3.0 del programa (Zeiss).

7. Western blot análisis.

1. Para determinar la expresión de la proteína WRN o las variantes en WRN transformado sgs1 o sgs1 top3 cepas, lisados ​​se prepararon de la siguiente forma y de las proteínas analizadas por immunblotting.

1. Transformado sgs1 o sgs1 top3 cepas fueron cultivadas en SC raf Trp menos a 30 ° C por la noche.
2. Los cultivos se inoculó y se incuba a 30 ° C hasta que la fase de registro temprano (OD ₆₀₀ de 0,5 - 0,8) y luego inducido mediante la adición de galones al 2% de concentración final. Culturas se permitió a crecer a 30 ° C durante 6 h.
3. Las células (3 ml) se recogieron por centrifugación y se lavaron con PBS. Sedimento celular se resuspendió en buffer de lisis alcalina [50 mM NaOH, pH 10,5, 2 mM EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 2% SDS, 10% de glicerol, el 5% 2-mercaptoetanol y los inhibidores de la proteasa (Roche Molecular bioquímicos)] , se hierve durante 5 minutos, se aclaró por centrifugación, y se neutralizó con HCl 1 M.
4. Proteínas a partir de cantidades equivalentes de lisado celular se resolvieron en geles de poliacrilamida 8-16% SDS.

2. Para determinar el nivel de expresión de la proteína WRN bajo la influencia de diferentes concentraciones de galactosa, las culturas se procesaron de la siguiente manera.

1. Transformado sgs1 top3 cepas fueron cultivadas en SC raf Trp menos a 30 ° C por la noche.
2. Los cultivos se inoculó y se incuba a 30 ° C hasta que la fase de registro temprano (OD ₆₀₀ de 0,5 - 0,8) y luego inducido mediante la adición de gal al 2% de concentración final. Culturas se permitió a crecer a 30 ° C durante 6 h.
3. Las células fueron cosechadas por centrifugación y se resuspendieron en tampón (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1% de desoxicolato de sodio, 1% Triton X-100, 0,1% dodecilsulfato de sodio [SDS]) que contienen inhibidores de la proteasa (0,05% PMSF, 0,05 mg / ml leupeptina).
4. Perlas de vidrio (425 a 600 micras) se añadieron a la mezcla, y las células se rompieron por agitación.
5. El homogeneizado resultante se centrifugó durante 5 min a 15.000 xg y la fracción sobrenadante se recogió.
6. De proteínas en las fracciones lisado se estimó por el método de Bradford.
7. Igual concentración de proteína de las fracciones de diferentes lisado se resolvió el 16.8% geles de poliacrilamida SDS.

3. Expresión de WRN o WRN proteínas mutantes se determinó por Western blot utilizando un anticuerpo de ratón WRN monoclonales dirigidos contra un epítopo de un purificado fragmento C-terminal de WRN [6] (1:1000, Spring Laboratorios Valle).

4. Incubación del anticuerpo primario fue seguido de incubación con un segundo (peroxidasa de rábano conjugada) de anticuerpos (1:5000). Blots fueron procesados ​​con un sistema de detección ECL Plus occidental por el protocolo del fabricante.

5. Para el análisis cuantitativo de Western blot, el aumento de las concentraciones de recombinante purificada se incluyeron Su-etiquetados de larga duración proteína WRN en geles de tal manera que en la cuantificación de la mancha de una curva lineal estándar se podría generar. Además, el extracto de células de la cantidad equivalente de células o g 20 de las muestras de levadura lisado se cargaron en geles para estimar la concentración de AVS.

6. ImageQuant análisis se llevó a cabo entonces en geles y la curva lineal estándar se ha generado.

7. Concentración de proteína WRN en concentraciones variables gal se estimó mediante la curva lineal estándar generados anteriormente.

8. Resultados representante

Todas las cepas utilizadas en este estudio son auxótrofos Trp. Por lo tanto, sgs1, sgs1 top3 y de tipo silvestre W303-1A cepas transformadas con YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN-fueron seleccionados sobre la base de su capacidad para crecer en presencia de los medios de comunicación SC menos Trp. Para examinar el efecto de la expresión WRN en el crecimiento de transformar sgs1 top3 células mutantes, los cultivos se sembró en placas que contienen SC menos los medios de comunicación Trp con un 2% gal para inducir la expresión WRN. Top3 decatenates entrelazadas moléculas de ADN generadas por Sgs1 helicasa durante la replicación [1, 2], por lo tanto, en ausencia de Top3, esfuerzo de torsión no se alivia con un resultado de crecimiento lento y la hiper-recombinación. La función genética de sgs1 es suprimir el fenotipo de crecimiento lento de un mutante top3. Si WRN podría sustituir a SGS1 en interacción genética con Top3, la restauración de top3 fenotipo de crecimiento lento en sgs1 top3 de lo esperado.

Como se muestra en la Figura 2A, la WRN transformado sgs1 top3 tensión creció mucho más lentamente en comparación con el vector transformado sgs1 top3 cepa. Sgs1 top3 transformadas con el plásmido YEp112SpGAL-SGS1 se incluyó como un control positivo (Figura 2A), lo que demuestra que de tipo salvaje Sgs1 expresado en el mutante sgs1 top3 fue capaz de complementar el fenotipo de crecimiento genéticamente. La transformada sgs1 top3 cepas crecieron de manera similar en la ausencia de gal como se muestra por 2 días (Figura 2). Expresión de WRN no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de los padres cepas de tipo salvaje (W3031A) o sgs1 (Figura 2B), lo que indica que el efecto de la WRN en el crecimiento celular es específica a la observada en el sgs1 top3 fondo mutante. Los estudios genéticos realizados con variantes WRN demostrado que helicasa WRN pero no la actividad exonucleasa se ​​requiere para la restauración del fenotipo de crecimiento top3 (Figura 3B). Un polimorfismo de un cambio de sentido de forma natural en WRN que interfiere con la actividad helicasa abolida su capacidad de restaurar top3 fenotipo de crecimiento lento.

top3 cepas mutantes se retrasan en la fase de S/G2 finales del ciclo celular [1], una característica que puede dar cuenta de su lento crecimiento. La mutación del gen SGS1 en el fondo top3 suprime el retraso en la fase de S/G2 del ciclo celular. Si la expresión WRN podría restaurar el retraso en la fase de S/G2 del ciclo celular en sgs1 top3, una población elevada de células grandes con núcleos reverdeció indivisa que se esperaría para sgs1 top3 células mutantes que expresan WRN. Como se muestra en la Figura 4, el porcentaje de grandes células injertadas fue mayor para sgs1 top3 / ABN que sgs1 top3 / vector, lo que sugiere la restauración de la de S/G2 establecer características de top3.

El sgs1 top3 doble mutante es menos sensible a MMS o HU que el mutante top3 único [2]. Dado que el crecimiento de células afectadas de WRN sgs1 top3, que examinó el efecto sobre la sensibilidad al sulfonato de methylmethane (MMS, un agente alquilante) e hidroxiurea (HU, un inhibidor de la replicación). Sgs1 top3 / ABN sensibilidad muestra que tanto los medicamentos comparables a sgs1 top3 / SGS1 (Figura 5). El análisis genético de variantes WRN reveló que WRN helicasa / ATPasa, pero no la actividad exonucleasa ABN, se requiere para su efecto sobre la sensibilidad a MMS y HU.

Figura 1. Presentación esquemática de la clonación WRN / ABN variantes en el vector YEp112SpGAL. Por favor, haga clic aquí para una versión más grande de la figura 1.

Figura 2. WRN expresión en sgs1 top3 restaura el fenotipo lento crecimiento de top3. Grupo A, sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL o WRN YEp112SpGAL fueron sembradas en una placa SC-Trp que contienen 2% o 2% de glucosa gal. Como control sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL SGS1 se sembró sobre los de las placas. Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 2 días y fotografiados. Grupo B, cepa de tipo salvaje padres W303-1A o cepa transformada con sgs1 YEp112SpGAL o YEp112SpGAL WRN fueron sembradas en una placa SC-Trp o bien que contiene 2% o 2% de glucosa gal . Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 4 días y fotografiados. Composición de las placas fue como en el panel A y B Grupo, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2.

Figura 3. WRN ATPasa / helicasa, pero no la actividad exonucleasa, es necesario para restaurar el fenotipo lento crecimiento de top3 en sgs1 top3 de fondo. Sgs1 top3 cepa transformada con ATPasa / helicasa-muertos (YEp195SpGAL K577M WRN), exonucleasa-muertos (YEp195SpGAL- WRN E84A), RQC mutante (YEp195SpGAL-WRN K1016A), o polimórficos mutante (YEp195SpGAL WRN-R834C) se sembró sobre SC-Trp placas que contienen 2% glucosa (Grupo C) o el 2% gal (Grupo B). Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 2 días y fotografiados. Composición de las placas fue como en el Panel de A. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 3.

Figura 4. WRN induce la expresión S/G2 arresto en sgs1 top3 células. Culturas logarítmicamente creciente de sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL, WRN YEp112SpGAL o YEp112SpGAL SGS1, y el vector transformado de tipo salvaje cepa parental fueron inducidos a una concentración de 2% gal durante 6 h. Los cultivos se cosechan, procesan para DAPI como se describe en Materiales y Métodos y se observaron con Axiovert 200 M microscopio (Zeiss, lente de 100x). Que se muestra es la DAPI del top3 sgs1 transformado con YEp112SpGAL (superior izquierda) y con YEp112SpGAL WRN (superior derecha). Las flechas indican las células con núcleo indivisible. Distribución de las células en G1 (células individuales) y S/G2 (células injertadas) se muestra en el panel inferior. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 4.

Figura 5. Efecto de la expresión de la sensibilidad WRN MMS y HU de sgs1 top3 cepa. Logarítmicamente crecimiento de cultivos de sgs1 top3 cepa transformada con YEp112SpGAL, YEp112SpGAL ABN, exonucleasa-muertos (YEp112SpGAL WRN-E84A), ATPasa / helicasa-muertos, (YEp112SpGAL K577M WRN) RQC mutante (YEp112SpGAL-WRN K1016A), polimórficos mutante (YEp112SpGAL WRN-R834C), YEp112SpGAL SGS1 y el vector transformado de tipo salvaje cepas parentales fueron vistos en una serie de diluciones de diez veces en SC-Trp placas que contienen glucosa o chica y ya sea MMS o HU en las concentraciones indicadas. Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 2 días (las placas de control) y 4 días (MMS y placas HU) y luego fotografiados. Por favor,9/1639fig5.jpg "> haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 5.

Una de las ventajas de la utilización de la levadura como un sistema modelo es la disponibilidad de los mutantes en la replicación del ADN definida y las vías de reparación que se conservan entre la levadura y los humanos. Mayor selección de transformantes albergar los genes específicos es fácil y fiable como las cepas de laboratorio son mutantes autotróficas y vectores con marcadores auxotróficos están fácilmente disponibles. El uso de estos vectores de la expresión de los productos de los genes puede ser regulada por su inclusión en el control de un promotor inducible (por ejemplo, el promotor inducible gal, etc.) Teniendo en cuenta estas ventajas, hemos desarrollado un sistema modelo basado en la levadura para estudiar los requerimientos funcionales del gen WRN humanos defectuosos en el síndrome de Werner en una vía que es potencialmente conservadas entre humanos y la levadura. Utilizando los métodos descritos, nos proporcionan la primera evidencia de que AVS puede funcionar en una vía genética que afecta a top3 relacionados con fenotipos. Nuestras observaciones pronta investigación más a fondo la posibilidad de que WRN funcionalmente interactúa con Top3α en las células humanas durante la replicación del ADN celular o de la recombinación. Es concebible que, en condiciones de BLM con deficiencias, WRN parcial puede sustituir BLM a través de su asociación con una proteína de la topoisomerasa.