İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

1. Maya Suşlarının

Yabani tip SGS1 top3 Suşlarının (WT; W303-1A, genotip, MAT ade2 1 canl-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trpl-l ura3-1) [2], bir sgs1 mutant (W1292-3C ; genotip MAT bir SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 ade2 1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) ve bir sgs1 top3 mutant (W1058-11C, genotip, MAT bir SUP4-o:: ​​URA3 sgs1-25 top3-2:: HIS3 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 trp1-1 ura3-1 rad5-535) [3] karakterize edilmiştir ve nazik sağlanan edildi Dr. Rodney Rothstein (Columbia Üniversitesi).

2. Plazmid DNA inşaatları

Olarak ele program aşağıdaki YEp112SpGAL WRN geni klonlandı.

1. Plazmid YEp195SpGAL-WRN WRN Site mutasyon (E84A eksonükleaz ölü, K577M helikaz ölü, R834C ve K1016A) QuickChange II XL site mutasyon kiti (Stratagene) mutajenik astar ve standart bir protokol kullanılarak inşa edilmiştir [4] Lofstrand laboratuarları (Gaithersburg, MD).
2. WRN ve ilişkili varyantları kodlayan DNA parçaları jel Sal I ve MLU I. çift sindirim sonra ilgili YEp195SpGAL-WRN yapıları arınmış
3. Jel saflaştırılmış parçaları sonra, Şekil 1'de gösterildiği gibi bir gal uyarılabilir kolaylaştırıcı kontrol altında YEp112SpGAL WRN veya WRN türevlerini oluşturmak için bir TRP1 seçilebilir işaretleyici içeren plazmid 2 mikron çok kopya vektör YEp112SpGAL Sal I MLU I siteleri klonlanmıştır .
4. Böylece elde edilen yapıları YEp112SpGAL-WRN YEp112SpGAL-WRN E84A YEp112SpGAL-WRN K577M YEp112SpGAL-WRN K1016A, ve YEp112SpGAL-WRN R834C olarak adlandırılmıştır.

3. Dönüşüm

Maya kültürleri Lityum Asetat tabanlı Gietz ark protokol kullanarak, standart bir protokol ve dönüşümler gerçekleştirildi kullanılarak yetiştirilen [5] . Kısaca, aşağıdaki adımları yapıldı.

1. Yukarıda sözü edilen suşların Kültürleri 5 ml YPD (maya özü-pepton-dekstroz) orta gecede büyüdü. Kültürler 50 ml YPD orta reinoculated ve 1.0 bir OD ₆₀₀ kadar büyümeye izin verildi - 1.2 ulaşmıştır.
2. Kültürler hasat, 20 ml su ile yıkanır ve 100 mM lityum asetat (LiAc) 1 ml yeniden süspanse edildi. Hücreler, 30 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edildi.
3. Hücre pelet on dönüşümler yapmak için yeterli olan 500 ul son hacim 100 mM LiAc yeniden süspanse edildi. Hücre süspansiyonu 50 ul aliquoted ve hücre pelletini santrifüj yoluyla toplanmıştır.
4. 250 ul% 50 polietilen glikol (PEG), 1 M LiAc, 2 mg / ml ssDNA (somon sperm DNA), plazmid DNA 5 ml (100 ng 25 ul 36 ul: Hücre pelet aşağıdaki sırayla eklendi 1000 ng), ve 50 ul su. Hücre pelet 1 dakika için vortekslenmiş.
5. Hücreler daha sonra 30 inkübe edildi, ° C 30 dakika 42 yaşında bir ısı şok izledi ° C'de 20 dakika süreyle.
6. Hücreler hasat ve 1 ml su içinde yeniden süspanse edildi. Plazmid YEp112SpGAL seçilebilir bir belirteci olarak trp içerdiğinden, yapı barındıran tüm mutant trp yetkin olacaktır. Bu nedenle, transformants SC (tam sentetik) glikoz medya Trp eksik ve 30 plakalar kuluçka süspansiyon kaplama tarafından seçildi ° koloniler görünene kadar C 3-4 gün için.

4. Genetik analiz WRN yavaş büyüme fenotipi restorasyon sgs1 top3 gerginlik dönüştürdü.

1. Streak analizi:

1. Wild-tip ebeveyn büyüme (W303-1A), sgs1 ya da sgs1 top3 suşları, YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL-WRN ile ilgili suşları içeren ya% 2 glukoz (SC eksi Trp plakalar üzerine çizgiler UYR ifade etkisini incelemek üzere glu) veya% 2 galaktoz (gal). Kontrol olarak, sgs1 top3 / YEp112SpGAL-SGS1 dahil edildi. Plakalar 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edildi.
2. Düşük UYR protein ekspresyon düzeyleri sgs1 top3 suşunun büyüme hızını etkiler WRN yeteneğini belirlemek için, sgs1 top3 gerginlik gal değişen konsantrasyonları içeren YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN dönüştürülmüş, ya da YEp112SpGAL-SGS1 SC eksi Trp plakalar üzerine çizgiler düşük% 2 gibi yüksek% 0.005 olarak. Tabaklar sonra 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edildi.
3. Sgs1 top3 arka planda yavaş büyüme fenotipi geri WRN fonksiyonel gereksinimlerini değerlendirmek için, sgs1 top3 YEp112SpGAL-WRN (E84A, K577M, R834C ve K1016A) ile dönüştürülmüş stre edildiSC belirtilen konsantrasyonlarda glu ya da gal içeren eksi Trp plakalar üzerine aked. Denetimler için, YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN veya YEp112Sp GAL-SGS1 dönüştürülmüş sgs1 top3 suşu dahil edilmiştir. Tabaklar sonra 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edildi.

2. Sıvı kültür analizi:

1. Sıvı kültüründe dönüştürülmüş sgs1 top3 suşlarının gelişimini değerlendirmek için, maya hücreleri SC raf eksi 30 ° C gecede Trp yetiştirilmiştir. Kültürler SC raf eksi Trp reinoculated ve 30 ° C erken log fazı (~ 0.5 OD ₆₀₀₎ büyüdü. Kültürler, daha sonra% 2 gal ve büyüme içeren SC _medya OD 0.05 reinoculated belirtilen zaman aralıklarında absorbans ölçüm izledi.

5. WRN hidroksiüre veya methylmethane-sülfonat hassasiyet Genetik analiz maya suşları dönüştürdü.

1. YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL-WRN dönüştürülmüş sgs1 veya sgs1 top3 suşlar suşları MMS ve HU hassasiyetine UYR ifade etkisini belirlemek için 30 SC raf eksi Trp yetiştirilen ° C
2. Kültürler SC raf eksi Trp reinoculated ve 30 ° C erken log fazı (~ 0,6 için 0,8 OD ₆₀₀₎ büyüdü.
3. Bu suşların on kat seri dilüsyonları Trp eksik SC orta kullanılarak hazırlanmıştır. Katlanarak büyüyen bir kültür, 5 x 10 ⁶ hücre alınmış ve 10.000 kat seri kadar seyreltilmiş. Her seyreltme dört mikrolitre HÜ veya MMS belirtilen konsantrasyonları içeren SC gal eksi Trp plakalar üzerine fark edildi. Plakalar 30 ° C'de inkübe edildi.
4. Kontrol olarak, yabani tip ebeveyn suşu (W303-1A) YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL-WRN, ya da sgs1 top3 / YEp112SpGAL SGS1 dönüştürülmüş yukarıda açıklandığı gibi tedavi edildi .

6. WRN Hücre döngüsü dağıtım sgs1 top3 gerginlik dönüştürdü.

1. WRN hücre döngüsü dağıtım çalışma için sgs1 top3 zorlanma, YEp112SpGAL, YEp112SpGAL-WRN veya YEp112SpGAL SGS1 dönüştürülmüş sgs1 top3 kültürleri ve vektör dönüştürülmüş yabani tip ebeveyn suşu (W303-1A) dönüştürdü SC raf yetiştirilen eksi trp 30 ° C, gece boyunca.
2. Kültürler OD _0.05 reinoculated ve erken log fazı (0.5 -0.6 OD ₆₀₀₎ til büyümeye izin verildi. WRN ifade% 2 final konsantrasyon gal ekleyerek neden oldu. Kültürler, daha sonra 30 büyümeye izin verildi ° C 6 saat
3. Kültürler sonra DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) boyama işlendi.
   1. Kültürler, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika için 5800 xg'de santrifüj hasat edildi.
   2. Hücreleri ile bir kez yıkandı 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde fikse edildi.
   3. Sabit hücreleri 1 X PBS ile iki kez yıkanır ve nihayet 1X PBS içinde yeniden süspanse edildi.
4. Hücreler lam üzerine alınıp DAPI (1 mcg / ml) (Vektör, ABD) ile birlikte, orta montaj Vectashield monte edildi. Ve kompozit diferansiyel girişim kontrast (DIC), hücreleri, Axiovert 200 M mikroskop (100x objektif Zeiss) ile incelendi. Floresan görüntüleri AxioVision, sürüm 3.0 programı (Zeiss) kullanılarak analiz edildi.

7. Western Blot analizleri.

1. WRN protein ifadesi veya dönüştürülmüş sgs1 veya sgs1 top3 suşları UYR varyantları belirlemek için, lizatları Aşağıdaki yöntem ve immunblotting analiz proteinler tarafından hazırlanmıştır.

1. 30 ° C geceleme SC raf eksi Trp Dönüştürülmüş sgs1 veya sgs1 top3 suşları yetiştirilmiştir.
2. Kültürler 30 reinoculated ve inkübe edildi ° C erken log fazı kadar (0.5 OD ₆₀₀ - 0.8) ve daha sonra% 2 final konsantrasyon gal ekleyerek indüklenen. Kültürler, daha sonra 30 büyümeye izin verildi ° C 6 saat
3. Hücreler (3 ml) santrifüj tarafından toplanan ve PBS ile yıkandı. Hücre pelet alkali lizis tamponu yeniden süspanse [50 mM NaOH, pH 10.5, 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF),% 2 SDS,% 10 gliserol,% 5 2-merkaptoetanol ve proteaz inhibitörleri (Roche Moleküler Biyokimyasallar)] santrifüj yoluyla açıklık, 5 dakika kaynatılır ve 1 M HCl ile nötralize.
4. Proteinler hücre lizat eşdeğer miktarda 8-16% poliakrilamid SDS jeller çözüldü.

2. Galaktoz konsantrasyonları değişik etkisi altında WRN protein ifade düzeyini belirlemek için, kültürler aşağıdaki gibi işlendi.

1. Dönüştürülmüş sgs1 top3 suşları, gece boyunca 30 ° C'de SC raf eksi Trp yetiştirilmiştir .
2. Kültürler ve sonra uyarılan ga ekleyerek ° C erken log fazı (0.8 0.5 OD ₆₀₀₎ kadar 30 reinoculated ve inkübe edildi.l% 2 final konsantrasyon. Kültürler, daha sonra 30 büyümeye izin verildi ° C 6 saat
3. Hücreler (50 mM Tris-Cl, pH 7.5,% 1 sodyum deoksikolatın,% 1 Triton X-100,% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS) içeren proteaz inhibitörleri (% 0.05 PMSF, 0.05 mg santrifüj hasat ve tampon yeniden süspanse edildi / ml leupeptin).
4. Cam boncuk (425-600 mikron) karışıma ilave edildi ve hücrelerin vorteks tarafından kırıldı.
5. Homojenizasyondan 15000 xg'de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatant fraksiyonu toplanmıştır.
6. Lizat kesirler Protein Bradford yöntemi ile tahmin edilmiştir.
7. Eşit, farklı lizat kesirler protein konsantrasyonu 8-16% poliakrilamid SDS jeller çözüldü.

3. İfade WRN veya WRN mutant proteinlerin WRN, saflaştırılmış C-terminal parçası bir epitop yöneltilen bir WRN fare monoklonal antikor kullanarak Western Blot tarafından tespit edilmiştir [6] (1:1000, Spring Valley Labs).

4. Primer antikor inkübasyon (yaban turpu peroksidaz-konjuge) ikincil bir antikor (1:5000) ile kuluçka izledi. Leke üreticinin protokol başına ECL Plus Western algılama sistemi ile işlendi.

5. Kantitatif Western Blot analizi için, Onun etiketli tam uzunlukta UYR protein leke ölçümü üzerine bir standart doğrusal bir eğri olabilir jeller dahil edildi rekombinant saflaştırılmış konsantrasyonları artmaktadır. Ayrıca, 20 mikrogram, maya lizat örnekleri hücreleri veya eşdeğer miktarda hücre özü WRN konsantrasyonunu tahmin etmek için jeller üzerine yüklendi .

6. ImageQuant analiz oluşturulmuştur jeller ve standart doğrusal bir eğri üzerinde yapıldı.

7. Değişen gal konsantrasyonlarda UYR protein konsantrasyonu, yukarıda standart doğrusal eğrisi kullanılarak tahmin edilmiştir .

8. Temsilcisi Sonuçlar

Bu çalışmada kullanılan tüm suşlar Trp auxotrophs. Bu nedenle, YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL-WRN ile dönüştürülmüş sgs1 sgs1 top3 ve vahşi tip W303-1A suşları SC eksi Trp medya varlığı büyümeye yeteneği temelinde seçilmiştir. UYR ifade dönüştürülmüş sgs1 top3 mutant hücreler büyüme üzerindeki etkisini incelemek için, kültürler UYR ifade ikna etmek için% 2 gal SC eksi Trp medya içeren plakalar üzerine çizgiler. Top3 decatenates çoğaltma [1, 2] sırasında Sgs1 helikaz tarafından oluşturulan DNA molekülleri iç içe geçmiş, bu nedenle, Top3 yokluğunda, burulma stres yavaş büyüme ve hiper-rekombinasyon rahatladım değildir. Sgs1 genetik işlevi yavaş büyüme top3 mutant fenotip bastırmak için. WRN Top3 ile genetik etkileşim içinde SGS1 yerine olsaydı, sgs1 top3 top3 yavaş büyüme fenotipini restorasyon beklenir.

Şekil 2A gösterildiği gibi, UYR sgs1 top3 gerilme vektörü ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak daha yavaş büyüdü dönüştürdü sgs1 top3 gerginlik dönüştürdü. Sgs1 top3 YEp112SpGAL SGS1 plazmid pozitif kontrol (Şekil 2A) olarak yer aldı dönüştürülmüş bu vahşi tip gösteren sgs1 top3 mutant ifade Sgs1 genetik büyüme fenotipi tamamlamak için mümkün oldu. 2 gün (Şekil 2A) gösterildiği gibi dönüştürülmüş sgs1 top3 suşları gal yokluğunda benzer büyüdü. WRN hücre büyümesi üzerine etkisi sgs1 top3 mutant arka plan gözlenen özgü olduğunu belirten WRN, İfade, ebeveyn wild-tip (W3031A) veya sgs1 suşları (Şekil 2B) büyüme üzerinde herhangi bir etkisi vardı. Genetik çalışmalar WRN helikaz değil eksonükleaz aktivitesi top3 büyüme fenotipi (Şekil 3B) restorasyonu için gerekli olduğunu göstermiştir UYR türevleri kullanılarak yapılan. Helikaz aktivite ile müdahale WRN doğal olarak oluşan bir missense polimorfizmi top3 yavaş büyüme fenotipi geri kabiliyetini kaldırıldı .

top3 mutant hücre siklusunun geç S/G2 faz gecikmeli [1], onların yavaş büyüme hesabını bir özelliğidir. Top3 arka planda SGS1 genin mutasyon hücre döngüsü S/G2 aşamasında gecikme bastırır. WRN ifade sgs1 top3 hücre döngüsü S/G2 aşamasında gecikme geri olsaydı, bölünmemiş çekirdekleri büyük aşılı hücrelerinin yüksek bir nüfus WRN ifade sgs1 top3 mutant hücreler için beklenir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, büyük aşılı hücrelerinin yüzdesi, S/G2 de restorasyon düşündüren sgs1 top3 / UYR sgs1 top3 / vektör daha yüksek bulunmuştur top3, karakteristik yatıyordu.

Sgs1 top3 çift mutant MMS veya HU top3 tek mutant [2] daha az duyarlıdır. Sgs1 top3 WRN etkilenen hücre büyümesi, gelecek methylmethane sülfonat (MMS, bir alkilleyici ajan) ve hidroksiüre (HÜ, çoğaltma inhibitörü) sgs1 top3 karşılaştırılabilir ilaçların hem sgs1 top3 / WRN görüntülenir duyarlılık duyarlılık üzerine etkisini incelemiştir / SGS1 (Şekil 5). Genetik analiz UYR varyantları WRN helikaz / ATPaz, ama UYR eksonükleaz aktivitesi, MMS ve HÜ hassasiyet üzerindeki etkisi için gerekli olduğunu ortaya koymuştur.

Şekil 1. YEp112SpGAL vektör klonlama WRN / WRN varyantlar için şematik sunumu için buraya tıklayın Şekil 1'de bir büyük versiyonu için.

Şekil 2. sgs1 top3 WRN ifade top3 yavaş büyüme fenotipi geri yükler. Paneli YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL WRN ile dönüştürülmüş, sgs1 top3 gerginlik,% 2 glu veya% 2 galon ya da içeren bir SC-Trp plaka üzerinde çizikler vardı . Kontrol olarak YEp112SpGAL SGS1 dönüştürülmüş sgs1 top3 gerginlik hem tabak çizgili oldu. Plakalar 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe ve sonra fotoğraflandı. Paneli YEp112SpGAL veya YEp112SpGAL WRN ile dönüştürülmüş B Wild tip ebeveyn gerginlik W303-1A veya sgs1 zorlanma% 2 veya% 2 glu gal içeren ya bir SC-Trp plaka üzerinde çizgili . Plakalar 4 gün boyunca 30 ° C'de inkübe ve fotoğrafları çekildi. Plakalar Bileşimi A ve B Paneli sırasıyla Masası'ndaki gibi oldu. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3 WRN ATPaz / helikaz, ama eksonükleaz aktivitesi, sgs1 top3 arka planda top3 yavaş büyüme fenotipi geri yüklemek için gereklidir. Sgs1 top3 suşu (YEp195SpGAL WRN K577M) ATPaz / helikaz ölü dönüştürülmüş, eksonükleaz ölü (YEp195SpGAL WRN E84A), RQC mutant (YEp195SpGAL WRN K1016A) veya mutant polimorfik (YEp195SpGAL-WRN R834C) ya% 2 glu (Panel C) veya% 2 galon (Panel B) içeren SC-Trp plakalar üzerinde çizgili oldu. Tabaklar, 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe ve fotoğrafları çekildi. Plakalar Bileşimi Panel A. Lütfen Şekil 3 büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4 WRN ifade YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN veya YEp112SpGAL SGS1 dönüştürülmüş sgs1 top3 gerginlik Logaritmik büyüyen kültürler S/G2 tutuklama sgs1 top3 hücreleri uyarır ve vektör dönüştürülmüş yabani tip ebeveyn zorlanma,% 2 gal konsantrasyonda indüklenen 6 saat Kültürler, hasat DAPI boyama Gereç ve Yöntem açıklandığı gibi işlenmiş ve Axiovert 200 M mikroskobu (Zeiss; 100x objektif) kullanarak gözlenmiştir. YEp112SpGAL (üstte solda) ile dönüştürülmüş sgs1 top3 DAPI boyama ve YEp112SpGAL WRN (üstte sağda) ile gösterilir. Oklar bölünmemiş çekirdeklerin hücreleri göstermektedir. G1 (tek hücreleri) ve S/G2 (aşılı hücreleri) hücreler Dağıtım alt panel gösterilmiştir. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5. Logaritmik YEp112SpGAL, YEp112SpGAL WRN eksonükleaz ölü (YEp112SpGAL-WRN E84A), ATPaz / helikaz ölü (YEp112SpGAL WRN K577M), dönüştürülmüş sgs1 top3 suşu kültürler büyüyen sgs1 top3 suşu MMS ve HU hassasiyet UYR ifade Etkisi. RQC mutant (YEp112SpGAL-WRN K1016A), polimorfik mutant (YEp112SpGAL-WRN R834C), YEp112SpGAL SGS1 ve vektör ebeveyn suşları içeren SC-Trp glu ya da gal ve ya MMS veya HU plakalar üzerine on kat seri dilüsyonları fark edildi vahşi tip değiştirdi Belirtilen konsantrasyonlarda. Plakalar 30 ° C 2 gün (kontrol plakaları) ve 4 gün (MMS ve HÜ plakaları) ve daha sonra fotoğraflandı inkübe edildi. Lütfen9/1639fig5.jpg "> Şekil 5 büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Maya kullanarak bir model sistem olarak güçlü yönlerinden biri, maya ve insanlar arasındaki korunmuş tanımlanan DNA replikasyonu ve tamiri yollar mutantlar mevcudiyetidir. Laboratuvar suşları auxotrophic işaretleri ile auxotrophic mutantlar ve vektörler hazır olarak belirli genlerin barındıran transformants daha fazla seçim, kolay ve güvenilir. Bu vektörler kullanarak gen ürünleri ifade uyarılabilir kolaylaştırıcı (örneğin, gal indüklenebilir organizatörü, vb.) Kontrolü altında koyarak düzenlenir. Bu avantajları göz önüne alındığında, potansiyel olarak insan ve maya arasında korunmuş bir yol Werner Sendromu kusurlu insan UYR gen fonksiyonel gereksinimleri okumak için maya dayalı bir model sistem geliştirdi. Açıklanan yaklaşımları kullanarak, WRN top3 ilgili fenotipleri etkileyen genetik bir yol olarak işlev görebilir ilk kanıt sağladı. Gözlemler WRN işlevsel, hücresel DNA replikasyonu ve rekombinasyon sırasında insan hücrelerinde Top3α ile etkileşim olasılığı daha fazla araştırma istemi . Makul bir BLM engelli durumuna WRN kısmen bir topoizomeraz ile protein ortaklık yoluyla BLM ikame edebilir.