Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

הקדמה

עוברים תסיסנית בין השלבים 14 ו 17 של ההתפתחות העוברית יכולים להיות גזור ברצון ליצור "פילה" ההכנות. בכל הכנות אלה, מערכת העצבים המרכזית (CNS) רץ באמצע, והיא מוקפת קירות הגוף. הבטן היא הוסרה. כאשר מוכתם נוגדנים, פילה לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של מערכת העצבים המרכזית ועל הקיר גוף מבנים (אקסונים המנוע למשל, השרירים, היקפי חושית (PNS) נוירונים, tracheae) מאשר לעשות הר שלם עוברים, כי אין להתערב רקמות בין הכנה לבין coverslip, ובגלל פילטים הם שטוחים, המאפשר המבנים משתרעים הקיר הגוף להיות דמיינו במטוס מוקד יחיד. פנוטיפים שונים רבים נבדקו באמצעות תכשירים אלה. ברוב המקרים, פילה מופקים על ידי דיסקציה של קבועים, נוגדן מוכתמת כולה הר עוברים. הכנות אלה קבוע נוצרות על ידי הפעולות הבאות: 1) הסרת סיסית עם אקונומיקה, 2) קיבוע עם paraformaldehyde / heptane; מכתים נוגדן 4) או באמצעות אימונוהיסטוכימיה immunofluorescence;; 3) הסרת vitelline קרום עם מתנול 5) קרחת גליצרול; 6) דיסקציה עם מחטים טונגסטן. פרוטוקולים מפורטות מכתים אלה "והניתוחים קבוע" ניתנים נ"צ. [1].

והניתוחים קבוע יש כמה חסרונות, עם זאת. ראשית, לעיתים קרובות קשה למיין קבוע, מוטציה צבעונית (GFP שלילי) עוברים מן המניות או חוצה שבו מוטציות מאוזנים על GFP balancers, גם כאשר אנטי GFP משמש לצורך זיהוי. זאת בשל מגוון גורמים, כולל ביטוי אימהי של ה-GFP. לדוגמה, מצאנו כי זה כמעט בלתי אפשרי למיין קבוע, עוברים מוטציה צבעונית הומוזיגוטים מן מאוזנת מניות כרומוזום third שימוש או אקטין-GFP או ארמדיל (זרוע)-GFP balancers. שנית, זה די זמן רב כדי לייצר באיכות גבוהה והניתוחים קבוע. 10-15 לשעה הוא כ מהר כמו רוב האנשים יכולים לעשות את זה. שלישית, נוגדנים מסוימים אינם כתם היטב והניתוחים קבוע, אם משום epitopes נוגדנים רגישים כדי לתקן, או בגלל נוגדן כתמים שני מבנים פנימיים וחיצוניים הוא "ספג" על ידי מבנים חיצוני ואינו לחדור למבנים הפנימיים ( למשל נוגדנים נגד fasciclin III (Fas3)). מכתים הרביעית, לחיות עם חלבונים היתוך קולטן לזהות ביטוי ליגנד לא ניתן לעשות זאת על ההכנות קבוע.

מאז 2002, הקבוצה שלנו כבר מנהלת חסר (DF) מסכי ביטוי אקטופי לזהות ligands RPTP. כדי לעשות זאת, פיתחנו פרוטוקולים יעילה עבור העובר לנתיחה מכתים לחיות האוספים המכיל מאות קווי מאוזנת. מכתים עבור ligands קולטן יתום עם חלבונים היתוך קולטן הוא יישום מיוחד שאינו מועסק על ידי קבוצות רבות. עם זאת, קבוצות רבות משתמשות מכתים נוגדן של פילה לדמיין פנוטיפים עובריים. באמצעות הפיתוח שלנו של שיטות אלה, אנו מגיעים למסקנה כי זה הרבה יותר יעיל לבחון פנוטיפים של אוספים גדולים של מניות על ידי לנתיחה לחיות מאשר דיסקציה קבוע. השתמשנו לנתיחה לחיות לאפיין מנוע האקסון, מערכת העצבים המרכזית פנוטיפים שריר יותר מ -600 DFS, ויש להם גם מאופיין פנוטיפים מערכת העצבים המיוצר על ידי ביטוי אקטופי של פני יותר מ -400 תאים שונים וחלבונים מופרשים (AW ואח' בהכנה. HK. L. et al., בהכנה).

הפרוטוקולים לנתיחה לחיות השתמשנו התפתחו לאורך השנים. אחד המחברים (KZ) הוצג לראשונה לחיות לנתיחה יותר מאשר לפני 20 שנה על ידי Nipam פאטל, שהיה אז סטודנט לתואר שני במעבדה קורי גודמן. בשנים האחרונות יותר, השתמשנו בשיטה זו כדי להכתים את מערכת העצבים המרכזית עם אנטי Fas3 [2], אבל חתכים קבועים המועסקים עבור כל הניסויים האחרים. בשנת 1999, הציג Aloisia שמיד, שהיה אז דוקטורנט בקבוצה שלנו, לנו לחיות דיסקציה עם מחטים זכוכית, אשר נהגה לבחון פנוטיפים של גדילי RNA-כפול הזריק עוברים [3, 4]. כשהתחלנו לעשות את ליגנד RPTP מסכי כמה שנים מאוחר יותר, אנחנו שונה הפרוטוקולים שלה, כדי לאפשר ניתוח מהיר של אוספים גדולים של מניות שמרו על ה-GFP balancers. מצאנו כי ה-GFP שלילי עוברי ניתן למיין בקלות מ-GFP מאוזנת מניות גם כאשר אין GFP משמעותי ביטוי אימהי (למשל עבור איזון TM3armGFP), כי עוברים ממוינות הבדלים חיים עדין בביטוי GFP ניתן לאתר בקלות. מסך DF מוצלח שלנו ליגנד Lar מתואר [5].

שימוש בפרוטוקולים הנוכחי שלנו, אדם מאומן יחיד יכול המסך קווי 5-10 ליום פנוטיפים, בחינת 4-7 עוברים מוטציה מכל קו תחת מיקרוסקופ המתחם. לאחר בחירת ו עריכה העוברים, זה לוקח כשעה לנתח 50 עוברים. שיטה זו מאפשרת לנו לזהות מוטציות המקנות עדין, נמוך penetraפנוטיפים nce, שכן עד 70 hemisegments בכל שורה הם הבקיע בהגדלה גבוהה עם עדשת מים טבילה 40X. פנוטיפים כזה יהיה קשה או בלתי אפשרי לזהות על המסכים של כל הר עוברים מוכתמת תחת מיקרוסקופ לנתח.

הגדרנו ערכת DF להקרנה פנוטיפי המכיל כ - 250 קווים מייצג כמחצית הגנום (AW et al., בהכנה). הפיתוח של הערכה זו החלה במסגרת המסך שלנו של DF Bloomington ערכת כפי שהיה קיים בשנים 2002-2003 עבור גנים הדרושים לסינתזה ליגנד RPTP [5]. במהלך המסך הזה, החלפנו Bloomington ערכת DFS עבורו DF / DF הומוזיגוטים לא לפתח מערכת העצבים המרכזית (ולכן לא יכול היה להיות מוקרן לביטוי ליגנד CNS) עם DFS קטנים, רצוי ממופה מולקולרי, שהיה פיתוח טוב יותר.

DF / DF הומוזיגוטים מקווי ערכת ההקרנה פנוטיפי שלנו מורפולוגיות הכוללת נורמלי בשלב 16, המאפשר חוקר מסך באופן שיטתי עבור גנים המשפיעים על התפתחות מערכת העצבים המרכזית, PNS, סיבי השריר, רשת קנה הנשימה, ורקמות רבות אחרות. כל מבנה, דפוס הביטוי, או תבנית לוקליזציה subcellular כי הוא visualizable עם נוגדן ספציפי או סמן GFP בשלבים 14-16 ניתן לגילוי באמצעות ערכת פנוטיפים. פירוש הדבר, באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, אחת ההוצאות אדם כמחצית שלו / שלה זמן על פרוייקט זה יכול שיטתי מסך מחצית מכלל הגנים תסיסנית עבור כל פנוטיפ עובריים הרצוי בתוך חצי שנה עד שנה אחת.

א תסיסנית אוסף העובר

1. הכן "חמש חבית" אוסף לתאי ביצה

לתאי אלו לחסוך זמן ומאמץ כאשר בוחנים מספר רב של קווי לעוף.

1. סדר five 50 מ"ל צינורות חרוטי במהופך על חלק התחתון של 100 x 15 מ"מ פטרי צלחת פלסטיק ודבק הצינורות יחד באמצעות דבק סיליקון איטום גומי.
2. פעם הוא דבק מוקשה, דבק בחלק התחתון של צלחת פטרי על קצות חרוטי של החצוצרות. חמישה צינורות חרוטי יעמוד בתוך צלחת פטרי.
3. באמצעות מחט לוהטת, לעשות חורים הצינורות עבור זרימת אוויר.

2. הכן אוסף צלחות ביצה

1. יוצקים על 7ml של ג'ל אגר ענבים (1%) בכל 100 x 15 מ"מ פלסטיק צלחת פטרי. עובי אידיאלי של ג'ל הוא כ 3-4 מ"מ כדי לאטום כל צינור חרוטי ולספק לחות למשך 24 שעות. אם הג'ל עבה מדי, הוא עלול ליפול כאשר אנו משנים את הצלחת.
2. לאחר להתקרר צלחות ג'ל, מכסים את אלה את התיק המקורי פלסטיק צלחת פטרי. חותם את התיק בחוזקה חנות ב 4 ° C.

3. הכן זבובים

1. על מנת לקבל מספיק ביצים לבחירה קלה של עוברים של השלב הנכון, אנחנו מנסים לשים> 50 בתולות לתוך צלב, יחד עם> 20 גברים.
2. אם הצלב הוא להיות מוקרן, לערבב זבובים זכרים ונקבות ולשמור בבקבוקון זבוב מזון עם הרבה כדורי שמרים יבשים בתחתית ורצועה נייר דק (10 X 100 מ"מ, מקופל לשניים) נטועים באמצע המזון. רצועת נייר תספק שטח יותר לשמור על זבובים מלחות מוגזמת.
3. שמור את צלוחיות עם זבובים ב RT לפחות 3 ימים.
4. אם המניה מבקבוק היא להיות מוקרן, פשוט להעביר זבובים לתוך תא האיסוף.

4. העברת טס חמש חבית לתאי איסוף ביצים.

1. לייבל את הקנה כל לתאי ביצה האוסף.
2. שים להדביק שמרים בצלחת ביצה אוסף עבור כל חבית.
3. הכן 20 אינץ תיוג סרט ארוך כדי להחזיק את החדר ואת צלחת יחד. מקפלים 10 מ"מ סוף כל שינוי צלחת קל.
4. להזריק גז CO ₂ של צלוחיות לטוס ולהעביר את הזבובים לתוך חביות שכותרתו.
5. מכסים את החדר עם צלחת איסוף ביצים ולחץ כלפי מטה.
6. קלטת סביב החדר ואת צלחת יחד החל באמצע צלחת אגר. הקלטת תהיה חפיפה על הצלחת אוסף ביצה.

5. איסוף עוברים

1. הכן אוסף צלחת ביצה: לשים שמרים להדביק על צלחת ביצה אוסף עבור כל חבית.
2. הקש את הזבובים בתאי איסוף ביצים להסיר את הסרט סביב החדרים (החזק את הצלחת הישנה בחוזקה).
3. הקש את הזבובים שוב ולהחליף את צלחת ישן עם חדש.
4. איסוף עוברים במצב מלוכסנות עבור 2-4 שעות.
5. החלף את אוסף ביצה צלחת בזמן הרצוי.

6. גיל העוברים

מניחים את הצלחת האוסף ביצה הפוכה על צלחת פטרי מכוסה נייר רטוב 90 מ"מ מעגל לסנן ולשמור בטמפרטורה הרצויה. עבור חתכים של שלב 16 עוברים מקווי מוטציה מאוזנת, אנחנו בדרך כלל לעשות אוסף בשעות הבוקר המאוחרות, אז דגירה עובריםr> 22 שעות ב 19 ° C. לרווח-of-פונקציה מחקרים באמצעות מערכת UAS/GAL4, אנו אוספים עוברים על RT אחר הצהריים דגירה של 16 שעות ב 19 ° C. למחרת אנו העברת עוברים ל 29 ° C חממה כדי להפעיל את מערכת UAS/GAL4 עבור שעה 1 או 2. אחרי פרק זמן זה, הם ברובם עוברים שלב 15, וזה מאפשר מספיק זמן כדי למיין עוברים לביטוי GFP ולסדר אותן, כך הם יהיו בשלב 16 כאשר לנתיחה נעשה.

7. Staging עוברים מיון ביטוי של GFP.

כדי להפלות גנוטיפים של עוברים, אנו משתמשים GFP balancers. אנו בוחנים עוברים dechorionated בקלטת פעמיים מקל (ראה סעיף הבא) תחת ה-GFP אולימפוס לנתח היקף, ואנו לבחור אותם לגיל ביטוי של GFP באותו זמן.

א) ה-GFP מיון:

1. איזון כרומוזום 2 אנו משתמשים (CyOarmGFP) יש GFP מונע על ידי האמרגן ארמדיל, אשר באה לידי ביטוי בכל האאקטודרם. Heterozygotes CyOarmGFP הם ירוק זית, הומוזיגוטים CyOarmGFP הם ירוק בהיר. במלאי CyoarmGFP, העוברים כי חוסר איזון יש להבחין בקלות, כי יש להם כמעט שום ביטוי של GFP (הם נראים כמו עוברי ממלאי עם איזון לא GFP).
2. איזון כרומוזום 3 (TM3armGFP) קשה יותר להשתמש למיון, כי יש ביטוי של GFP יותר אימהי מונע. כתוצאה מכך, עוברים מחולקים לקטגוריות יותר וירוק יותר. בעזרת תרגול מסוים, היא פשוטה בדרך כלל כדי למיין את העוברים פחות ירוק יותר אחד מהשני, אבל זה גם הכרחי לנקוט אותם באשכולות אותם בוחרים את העוברים מדי פעם כי הם ירוקים יותר מהאחרים (heterozygotes TM3armGFP) לאחר העברת הצלחת אגר. אחרת, יש בטוח להיות כמה עוברי כי הם גנוטיפ שגוי.
3. איזון X הוא FM7 Kr-GAL4, כטב"מ-GFP. זה בא לידי ביטוי דפוס רקמות ספציפיות. דפוסי שרלוונטיות מיון בשלבים 15-16 הם amnioserosa ושתי נקודות של ביטוי בראש, שהם תאים של איבר Bolwig. למרבה הצער, בשלב שבו אחד רוצה מין העוברים, amnioserosa הוא דוהה ואיברים של Bolwig טרם החלו לזהור. זהו אפוא צורך לבחון בזהירות רבה את העוברים בקלטת, לעיתים קרובות מתגלגל אותם, כדי להבקיע אותם GFP, והוא חיוני לנקוט אותם בצלחת אגר. בדרך כלל אנחנו עושים את זה פעמיים: פעם אחת מיד לאחר הזזת כל עוברי מהקלטת הצלחת, ושוב לאחר הזדקנות לשלב המתאים, רגע לפני הציפוי אותם כהכנה לניתוח. לפעמים אנחנו גם לבחון מחדש את השקופית תחת היקף GFP לאחר העברת העוברים לבריכה PBS (ראה להלן), כי ויזואליזציה של ה-GFP הוא טוב יותר בתנאים אלה. ואז, אנו יכולים להשמיד עוברים כי יש GFP ממש לפני תחילת לנתיחה.

ב) קביעת

הכלי העיקרי הזמני עוברים סביב רחוב. 14-16 הוא מורפולוגיה במעיים. בטן זוהר עם autofluorescence תחת היקף GFP. לפני ניסיון עוברים שלב, יש להתייעץ ספרי עיון או אתרים שיש להם תמונות ותרשימים של עוברים (למשל Hartenstein קמפוס, אורטגה ספר ירוק), כך שאף אחד מבין מה הם צריכים להיראות. השלב האידיאלי הוא כאשר הבטן לנתיחה יש לחלק לשלוש להקות. לפני כן, במעיים מופיע כתם יחיד. לעתים קרובות אחת מיני עוברי בשלב כתם ואחר כך הגילאים בהם עד שהם מגיעים לשלב הכי טוב לניתוח. לאחר שלב שלוש הלהקה, הבטן מתחילה לפתח להקות אלכסוני ליד הזנב ולאחר מכן סלילים, ועל העובר מתבהרת. במהלך תקופה זו, העובר הופך להיות קשה לנתח כי זה לא ידבק לשקופית זכוכית. אם רוצים לנתח בשלב מאוחר 16/early שלב 17 עוברים, יש צורך לנתח ולהעריך עוברים רבים אשר מורפולוגיות המעיים קשורים עוברי כי מקל או לא מקל. זה משתנה במקצת בין גנוטיפים גם כן.

ב תסיסנית לנתיחה העובר חי

1. העובר dechorionation
   1. הכן דו צדדית סרט דביק צלחת לוח ענבים בשקופית
   2. העברת עוברים בני מהצלחת איסוף לקלטת דו צדדית הדביק בעזרת מכחול רטוב. מורחים עוברים באופן שווה.
   3. Dechorionate את העוברים על קלטת דו צדדית הדביק על ידי גלגול אותם על פני אותו בעדינות עם מחט לנתח קהה. לאחר dechorionation, העוברים ידבק חזק יותר לסוף המחט מאשר עוברים אחרים או סיסית, אך לא בעוצמה כמו לקלטת, כך אפשר לחמניות העוברים על גבי סיסית או על עוברי אחרים, ואז מרים אותו ומעבירה אותו אל הלוח צלחת ענבים. Genotyping ובימוי (ראה לעיל עבור תיאור מפורט) נעשית בתהליך של dechorionation ולהעביר את המחט.
   4. לאחר פנייה של גנוטיפ וגיל, להעביר את העוברים על לוח מלבני קטן של אגר, רוחב מספיק כדי לאפשר הזדנבות של 10-15 עוברים ברציפות. יישר את העוברים dechorionated על הלוח הזה: למטה בצד הגבי נגד מסתיים אגר לוח ו האחורי פונה כלפיך. בדרך כלל אנחנו עושים שורות של עוברי 5-10.
2. הכן שקופית עוברים והעברת לנתיחה לחיות
   1. חותכים חתיכה מלבנית קטנה של סרט דביק דו צדדית ולמקם אותו ליד קצה אחד של שקופיות פרוסט / סופר פלוס (פישר סיינטיפיק, חתול # 12-550-15).
   2. צייר מלבן (30-40 מ"מ ארוך, מלא את רוחב השקופית) סביב קלטת עם עט שעווה, כך שיש ~ 3 מ"מ רווח בין השעווה קלטת (סופר פן HT פאפ, www.rpicorp. com ) ולהעביר את העוברים מן הלוח צלחת ענבים על לקלטת, על ידי להחליק את היפוך בעדינות הורדת אותו על העוברים, כך הקלטת בא במגע עם בשורה למעלה עוברי (נעשה תחת בהיקף לנתח). עוברים צריך להיות מיושר כך בסוף האחורי היא כלפיך. הם עכשיו יהיה למעלה בצד הגבי בשקופית.
   3. מיד להוסיף 1X PBS (מתכון Gibco) על פני העוברים למלא את המלבן שעווה.
3. העובר חי לנתיחה
   1. בעזרת מחט זכוכית דיסקציה (גרם של מחט מזרק), חתך לאורך קו האמצע הגבי, החל מהקצה האחורי של העובר.
   2. נקבו את הקצה הקדמי של העובר, להרים ולהעביר את העובר כדי להחליק את זה עד מקלות. שמור עוברים למאגר. הפוך את קו מסודר של עוברים בשקופית המתאימה לכל שורה על הלוח אגר. ארגן את השורות, כך שהם יהיו בכושר כל בשקופית.
   3. יש מגוון של רצפי לנתיחה אפשרי שיכול לשמש ביצירת פילה. אנשים בדרך כלל לפתח תהליכי אופטימיזציה שלהם באמצעות ביצוע חתכים עצמם. הסרטון מדגים הרצף שבו חתך קטן הוא עשה בסוף האחורי של העובר כדי להפריד את שני הצדדים של החומה גוף אחד מהשני. אם תרצה, אפשר גם לשבור את קשר midgut / במעי האחורי לחתוך עם זה, לעקור את במעי האחורי מחוץ לשקופית בשעה זו (בסרטון, תזוזה במעי האחורי נעשה מאוחר יותר). ואז, הקיצוצים נעשים בכל צד האחורי רק כדי האונות במוח על מנת להפריד בין קירות הגוף מהמוח. בהתאם לגיל העובר, ניתן גם צורך לבצע חתך רדוד לאורך קו האמצע הגב כדי לנתק את הקשר amnioserosal בין קירות הגוף.
   4. ואז, בעדינות להדביק את דשי של קיר הגוף לשקופית, הימנעות מתיחה אותם או הסרת חומר מפני השטח שלהם. הדבר נעשה על ידי מיטב בלבד ומאפשר למחט ליצור קשר עם פינות הקדמי ואת האחורי בקצוות הגב לקיר הגוף. אקסונים המנוע לא להאריך עד הלום dorsally, אז במקרה הטוב זה יהיה לייצר עובר עם סניפים ISN שלם לחלוטין. במקרים מסוימים ISN יקוצצו, אפילו עם הטכניקה הטובה ביותר, כי העובר לא תמיד להפריד בדיוק לאורך קו האמצע הגבי. אם נעשה בצורה נכונה, שיטה זו תשמור על קיר מבנה גוף מגזרים T3-A6 (כ).
   5. אפשר לעזוב את midgut בראש של העובר, ולאחר מכן להסיר אותו מכל עוברי גזור לאחר שסיים את כל והניתוחים. הדבר נעשה על ידי דוקר את הבטן, והותירו אותו הרחק העובר, ומותח אותה כדי לשבור את החיבור שלו במעי הקדמי, הנמצאת תחת האונות במוח. לחלופין, ניתן להסיר את המעיים של דיסקציה כל אחד משלים זה. עם מוטנטים כי יש התפתחות המעיים תקינה, היא יתרון להסיר את כל אומץ מיד לאחר שסיים את והניתוחים, כי חלמון שוחרר מהבטן יכול להקשות על מקל עוברים לאחר מכן, הועבר לשקופית לאחר העברת הקלטת doublestick . לפעמים זה עוזר להעביר את העוברים מתחיל בתחתית המגלשה (לכיוונך) ולא בראש, כמו חלמון נוטה להתפשט כלפיך בשל תנועות טיפוסי של המחט.
4. קיבוע ו immunofluorescence / אימונוהיסטוכימיה
   1. בשלב זה, אפשר גם לתקן את העוברים מיד, אם הוא מכתים עם נוגדנים, או אחד יכול להסיר את PBS ולהחליף אותו supernatant חלבון היתוך, אם הוא עושה ניסוי מכתים לחיות כדי לזהות ביטוי ליגנד. היבט זה של הניסוי מתואר בפירוט את שיטות ושיטות חלקים משלימים של השופט. [5].
   2. כאן אנו מתארים את פרוטוקול קיבעון, אשר נעשה או מיד או לאחר מכתים חלבון היתוך. השימוש בשתי pipettes פסטר, להחליף את PBS עם paraformaldehyde 5% PBS (EMS, חתול. # 15713-S, www.emsdiasum.com). שערי בתמיסה לתקן שלוש פעמים, אשר כוללת שימוש ~ 6 מ"ל של תמיסת לתקן, מאז פיפטה פסטר מחזיקה1.5-2 מ"ל של פתרון. תקן עבור 45 ".
   3. הסר לתקן פתרון, להחליף עם PBS (3 שינויים), ואז עם PBT (PBS 0.1% + טריטון X-100 + 1 מ"ג / מ"ל ​​שבר V BSA: 3 שינויים), ואז להחליף PBT עם פתרון לחסום ~ 200 μl (PBT + 5 חום שטופלו% עז בסרום נורמלי), ואז עם נוגדן הראשוני הרצוי פתרון לחסום. חשוב מאוד לא לאפשר המניסקוס ליצור קשר עם העוברים, במיוחד בזמן שהם PBS, כי זה יהרוס את והניתוחים. אחרי ניקוי נוסף עוברים הופכים רגישים פחות המניסקוס. לפיכך, אפשר להחליף את PBT עם בלוק על ידי מפנה את השקופית ו סופג את רוב הפתרון על ידי נגיעה Kimwipe בקצרה לפינה של האזור המוקף השעווה. השיטה זהה ניתן להשתמש כדי להחליף את הבלוק עם פתרון אנטי הגוף. זה ממזער שריד של פתרונות.
   4. דגירה לילה ב 4 ° C, ואז לשטוף 3X עם PBT (> 15 דקות / לשטוף) במגש על פלטפורמה נדנדה (לוודא שיש מספיק PBT כך להחליק תמיד שקוע לחלוטין במהלך נדנדה), reblock כמתואר לעיל, להוסיף 200 נוגדנים משני μl, דגירה 2 שעה. ב RT, לשטוף מחדש עם PBT. בדוק מכתים (אם פלואורסצנטי ירוק משמשת) אם רוצים תחת GFP הניתוחים היקף.
   5. לשטוף 2X עם PBS (5 '), ואז להוסיף 500 μl 70% glycerol/1X PBS (שנעשו על ידי ערבוב 35 מ"ל גליצרול, 5 מ"ל PBS 10X, ו - 10 מ"ל מים בצינור 50 מ"ל), וברור לילה בשעה 4 ° C (או שעה 2 ב RT). הסר גליצרול ולבש coverslip 1 #.

אנו מקווים כי זה הפגנה וידאו מוצגת השיטות שלנו לנתיחה העובר מכתים לחיות בפירוט מספיק שהם יכולים כעת להתבצע בקלות על ידי כל אדם שיש לו קצת ניסיון תסיסנית גנטיקה האמבריולוגיה. כמובן, בפועל ניכר עדיין יהיה נדרש, בעיקר עבור והניתוחים עצמם. מניסיוננו, כל אדם לומד את שיטות לנתיחה לחיות תיצור פרוטוקול לנתיחה קצת שונה המאפשר לו / לה ביותר במהירות לייצר באיכות גבוהה והניתוחים ערוכים. תהליך זה דורש חודשים לפיתוח מלא. עם זאת, רוב האנשים יכולים לייצר באיכות גבוהה והניתוחים אחרי כמה שבועות של תרגול.

למרות שאנחנו בעד השימוש והניתוחים לחיות להקרנה, הם לא יכולים להחליף והניתוחים קבוע, כי פרוטוקולים לנתיחה קבוע יכול להיות מיושם על מגוון רחב יותר של בשלבים עובריים. למשל, בניתוח של הערכה שלנו DF עבור פנוטיפים מנוע האקסון הדרכה, מצאנו כי את הפרטים של הסניפים מנוע האקסון, כולל filopodia, יכול להיות הרבה יותר טוב דמיינו ידי מכתים immunofluorescent של פילה לחיות מאשר peroxidase חזרת קונבנציונאלי (HRP) ויזואליזציה immunohistochemical של פילה קבועה (דוגמאות של צביעת HRP באיכות גבוהה, לראות את פריימר של הדרכה האקסון המוטורי בעמוד שלנו במעבדה אינטרנט). עם זאת, עוברים מעל גיל תחילת שלב 17 לא ידבק SuperFrost פלוס שקופיות עקב התפתחותם של לציפורן. כך, ניתוח כמותי של פנוטיפים עבור מאוחרת בפיתוח ענפי האקסון המוטורי כגון SNA, אנחנו עדיין מסתמכים על חתכים קבועים (AW et al., בהכנה).

נכון לעכשיו, שיטות אלה יש רק הוחל על כמה בעיות על ידי הקבוצה שלנו. אלה כוללים זיהוי וניתוח פנוטיפי של גנים חדשים הקשורים למערכת העצבים המרכזית ואת המנוע הדרכה האקסון, זיהוי ligands קולטן יתום, וזיהוי הגנים הדרושים לסינתזה של epitopes מוכר על ידי מבז ספציפיים. עם זאת, ויישומים רבים אחרים ניתן חזה, במיוחד כאשר השימוש בשיטות אלה, בשילוב עם ניתוח של הערכה שלנו DF ואיסוף ביטוי חוץ רחמי, או אוספים שנוצר על ידי חוקרים אחרים. כך, למשל, צריך להיות אפשרי עבור מסך שיטתי גנים הדרושים לסינתזה, דפוס הביטוי התאי, או לוקליזציה subcellular של חלבון כלשהו שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן באיכות גבוהה או עיתונאי ה-GFP.