Lensless On-chip Beeldvorming van cellen verschaft een nieuw instrument voor High-throughput Cell-Biologie en Medische Diagnostiek

Hier bespreken we de experimentele procedures die betrokken zijn bij LUCAS [1-3]. Ter illustratie van de proof of concept van LUCAS beschrijven we de imaging-proces voor een volbloed sample.

A. Imaging Set-up

De LUCAS Imaging platform vertoont belangrijke voordelen op een kosteneffectieve en compact alternatief voor bestaande point-of-care cytometrie en medisch-diagnostische instrumenten, met name voor gebieden met beperkte middelen. In plaats van het detecteren van het beeld van de cellen, LUCAS legt in plaats van digitale hologrammen van de cellen die zijn gemaakt door de inmenging van de verstrooide licht van elke cel met de achtergrond licht. Zorgvuldige controle van de gedeeltelijke ruimtelijke samenhang van de verlichting is van cruciaal belang holografische opname mogelijk te maken.

1. Digitale Sensor Array

Het LUCAS-platform maakt gebruik van een opto-elektronische sensor array om digitaal op te nemen individuele cel hologrammen. Voor dit doel, belast paar apparaten (CCD, Sample Modellen: KAI-11002, KAF-39000, van Kodak) of Complementary Metal-Oxide-halfgeleider chips (CMOS, Sample Model: MT9P031, Micron) kunnen worden gebruikt. Pixel maten voor de Kodak betaalt paar apparaten, KAI-11002, KAF-39000, en Micron CMOS sensoren zijn 9 micrometer, 6,8 micrometer en 2,2 micrometer, met een actieve beeldhoek van 10 cm2, 18 cm2, en 24,4 mm2, respectievelijk. [1-2].

2. Lichtbron

Tegenstelling tot de meeste andere microscopische beeldvorming, heeft LUCAS niet nodig een laser en dus zelfs een eenvoudige light emitting diode (LED) kan worden gebruikt voor verlichting worden. Met het oog op afstembare golflengte verlichting mogelijk te maken, kunnen we ook gebruik maken van een monochromator met een Xenon Lamp (Cornerstone T260, Newport Corp), samen met een standaard kwaliteit fused silica vezel die bestaat uit een bundel van vezels (77564, Newport) en pinhole van ~ 100 micrometer diameter ligt op ~ 5-10 cm boven de sensor oppervlak. Deze instelbare golflengte verlichting configuratie biedt een flexibel platform waar het holografische handtekening van de cellen kan worden aangepast, en de hybride digitale handtekeningen kunnen worden gesynthetiseerd om de signaal-ruisverhouding te verbeteren voor een betere karakterisering nauwkeurigheid en specificiteit. [3]

B. Monstervoorbereiding en Imaging

Een proof of concept van LUCAS gebaseerd op imaging-chip zal worden aangetoond met behulp van een heterogene oplossing zoals hieronder beschreven. Een soortgelijk protocol kan worden toegepast voor diverse andere celtypes [1-3].

1. Volbloed verdunning en de voorbereiding van de heterogene oplossing

1. Om te beginnen het proces, het verkrijgen van een volbloedmonster en polystyreen microbolletjes van verschillende diameters (5, 10 en 20 urn. Duke Scientific), en breng ze allemaal op kamertemperatuur.
2. Voeg 2 ml RPMI 1640 classic vloeibare media (Fisher Scientific) als een verdunningsmiddel in een steriele 5 ml polypropyleen buis.
3. Na het incuberen van het volbloedmonster gedurende 30 minuten, pipet een stijging van 10 pi van gesedimenteerde erythrocyten monster en breng deze in de RPMI oplossing.
4. Voeg een totaal volume van 20 ul polystyreen microbolletjes in erytrocyten RPMI verdunning, en schud de cel oplossing door voorzichtig pipetteren of met behulp van magnetische roerder met een roerstaafje.
5. Plaats een totaal volume van 5-15 il heterogene oplossing op een dekglas en plaats een tweede, identieke dekglas over de oplossing met behulp van een tang. Het monster moet worden ingeklemd tussen de twee dekglaasjes gelijkmatig.
6. Dan, met een vacuüm pen (NT57-636, Edmund Optics) belasting van het monster op het actieve gebied van de sensor-array voor de beeldvorming.

2. Volbloed kleuring

1. Te beginnen met de voorbereiding van een mengsel van 0,1% gebufferd Eosine Y en de verwaterde New methyleenblauw-oplossing met behulp van power soort pure Eosine Y (MW = 691,85, Acros Organics), zink, zuivere New methyleenblauwactieve kleurstof (MW = 347,90, Acros Organics), en Kalium Oxalaat monohydraat (99,0% reagens ACS, Acros Organics), elke oplossing is gezuiverd met een 0,45 pm poriegrootte Syringless Filter (Whatman) voor waterige witte bloedcellen vlekken.
2. Dan, voorzichtig roeren een waterige vlekken opgelost reagens met de hele bloed monster met een volume-verhouding van 1:1 in een polypropyleen beker met behulp van een magnetische roerder gedurende 2 minuten en incubeer gedurende 10 minuten.
3. Overdracht een gekleurd bloed oplossing van 50 uL in een 5 ml polypropyleen buis en verdunnen met RPMI 1640 classic vloeibare oplossing (Fisher Scientific) van 1,95 ml tot een volume verhouding van 1:200 te verwerven. Dan, vortex de verwatering voor 30 seconden. Een andere verdunning tarief kan ook worden ingevoerd in dit stadium.
4. Pipetteer een gekleurde cel oplossing van 10-100 pi tussen dekglaasjes of binnen een microfluïdische reservoir. Dan, met een vacuüm pen (NT57-636, Edmund Optics), plaats het monster op het actieve gebied van de sensor array.

Representatieve resultaten

Figuur 2: (Links) Raw beeld van een heterogeen mengsel die rode bloedcellen bevatten, 10um, 5UM en 3 um deeltjes. (Rechts) Volledig geautomatiseerde LUCAS karakterisering resultaten voor hetzelfde gezichtsveld worden geïllustreerd. Merk op dat de beslissing algoritme is robuust in het karakteriseren van hoge dichtheid regio's en als deeltjes met een lage signaal-ruisverhouding, zoals de 3um kralen.

Figuur 3: De LUCAS aangepaste interface is geïllustreerd. Java gebaseerde software maakt LUCAS-ingangen voor verschillende experimentele condities, zoals de sensor pixelgrootte of de golflengte van het licht. Selectie van een specifiek gebied van visie op de afbeelding kan ook worden gemaakt en de doelcel patronen kunnen worden gedefinieerd door de gebruiker om een ​​statistisch cell schaduw bibliotheek te bouwen. De verworven LUCAS afbeelding kan dan worden gekarakteriseerd op basis van deze training data (dat wil zeggen, de cel schaduw bibliotheek) en de gemarkeerde (geteld) beeld wordt weergegeven aan de gebruiker. Statistieken van de graaf resultaten zijn ook opgeslagen als een XML-bestand voor verdere analyse.

We hebben laten zien dat de LUCAS platform nauwkeurig kan tellen en identificeren van verschillende micro-objects/cells op een chip op basis van hun holografische handtekening, en biedt een veelbelovend instrument voor point-of-care medische diagnostiek en high-throughput cel-biologie. Om nauwkeurig de opgenomen holografische patronen proces, implementeerden we een op maat ontwikkelde LUCAS beslissing software. Dit algoritme, dat een statistische diffractie-beeldbank gemaakt door het trainen van LUCAS beelden gebruikt, identificeert de verschillende eigenschappen van cellen binnen een heterogene oplossing, classificeert het type en de relatieve positie van de individuele cellen en telt het gewenste celtype na het aanbrengen van drempelwaarden om ongewenste deeltjes weggooien / cel patronen [1-3].

Samengevat moet de LUCAS platform te bieden een kostenefficiënte en compacte oplossing voor point-of-care cytometrie en medische diagnostiek. Voor dit doel zal LUCAS in het bijzonder nuttig zijn voor de controle van HIV-patiënten in met beperkte middelen, alsook voor andere wereldwijde gezondheid gerelateerde problemen, zoals malaria en tuberculose.