Senza lenti on-chip Imaging di celle fornisce un nuovo strumento per High-throughput Cell-Biologia e diagnostica medica

Qui discutiamo le procedure sperimentali che sono coinvolti nella LUCAS [1-3]. Per illustrare la prova del concetto di LUCAS verrà descritto il processo di imaging per un campione di sangue intero.

A. Imaging Set-up

La piattaforma LUCAS Imaging presenta notevoli vantaggi per fornire un'alternativa conveniente e compatto agli attuali point-of-care citometria e strumenti di diagnostica medica, soprattutto per le risorse limitate. Invece di rilevare l'immagine delle celle, LUCAS cattura invece ologrammi digitale delle cellule che vengono creati dalla interferenza della luce diffusa da ogni cellula con la luce dello sfondo. Attento controllo della coerenza parziale spaziale della luce è fondamentale per attivare la registrazione olografica.

1. Sensore Array digitale

La piattaforma LUCAS utilizza una matrice di sensori optoelettronici per la registrazione digitale ologrammi singola cella. A tal fine, pagano due dispositivi (CCD; modelli di esempio: KAI-11002, KAF-39000, da Kodak) o Complementary Metal-Oxide Semiconductor chip (CMOS, Modello Esempio: MT9P031, Micron) possono essere utilizzati. Le dimensioni dei pixel per il Kodak carica dispositivi coppia, KAI-11002, KAF-39000, e sensori di immagini CMOS Micron sono 9 micron, 6,8 micron e 2,2 micron, con un FOV attivo di 10 cm2, 18 cm2, e il 24,4 mm2, rispettivamente. [1-2].

2. Fonte di luce

A differenza di molti altre modalità di imaging microscopico, LUCAS non necessita di un laser e quindi anche un semplice diodo ad emissione luminosa (LED) può essere utilizzato per l'illuminazione. Al fine di consentire l'illuminazione regolabili lunghezza d'onda, possiamo anche utilizzare un monocromatore con una lampada allo xeno (Cornerstone T260, Newport Corp.) insieme ad uno standard di qualità in fibra di silice fusa che consiste in un fascio di fibre (77.564, Newport) e foro stenopeico di ~ diametro di 100 micron trova in ~ 5-10 cm sopra la superficie del sensore. Questo parametro sintonizzabile configurazione illuminazione lunghezza d'onda fornisce una piattaforma flessibile in cui le firme olografica delle cellule può essere regolata, e ibridi firme digitali possono essere sintetizzati per migliorare il rapporto segnale-rumore per una precisione migliore caratterizzazione e la specificità. [3]

B. Preparazione del campione e Imaging

Un proof of concept di LUCAS basati su chip di imaging sarà dimostrata utilizzando una soluzione eterogenea come descritto di seguito. Un protocollo simile potrebbe essere applicata per vari altri tipi di cellule [1-3].

1. Diluizione del sangue intero e preparazione della soluzione eterogenea

1. Per iniziare il processo, ottenere un campione di sangue intero e microsfere di polistirolo di vari diametri (micron 5, 10, e 20. Duke scientifico), e portare tutti a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 2 ml di RPMI 1640 liquidi classico (Fisher Scientific) come diluente in una sterile 5 ml tubo in polipropilene.
3. Dopo l'incubazione del campione di sangue intero per 30 minuti, pipetta fino a 10 ml di eritrociti sedimentati campione e trasferirlo nella soluzione RPMI.
4. Aggiungere un volume totale di 20 microlitri microsfere di polistirolo in eritrociti diluizione RPMI, e agitare la soluzione delle cellule pipettando gentilmente o con agitatore magnetico con ancoretta.
5. Posizionare un volume totale di 5-15 ul di soluzione eterogenea su una copertina slip e un secondo posto, scivolare identica copertura rispetto alla soluzione utilizzando pinze. Il campione deve essere inserita tra i due coprioggetto in modo uniforme.
6. Quindi, utilizzando una penna a vuoto (NT57-636, Edmund Optics) caricare il campione attraverso la regione attiva della matrice di sensori per l'imaging.

2. Sangue colorazione intero

1. A partire dalla preparazione di una miscela di 0,1% tamponata eosina Y e una soluzione diluita di metilene New sfruttando l'energia di tipo puro eosina Y (PM = 691,85, Acros Organics), senza zinco puro New colorante blu di metilene (PM = 347,90, Acros Organics), e Monoidrato di ossalato di potassio (ACS reagente 99,0%, Acros Organics), ogni soluzione è purificato con una dimensione di 0,45 micron pori Syringless filtro (Whatman) per acquosa colorazione dei globuli bianchi.
2. Poi, mescolare delicatamente un reagente sciolto colorazione acquosa con il campione di sangue intero con un rapporto 1:1 in volume di un bicchiere in polipropilene utilizzando un agitatore magnetico per 2 minuti e incubare per 10 minuti.
3. Trasferire una soluzione macchiato del sangue di 50 microlitri in un tubo di polipropilene 5 ml e diluire con RPMI 1640 classica soluzione liquida (Fisher Scientific) di 1,95 ml di acquisire un rapporto tra volume di 1:200. Poi, il vortice di diluizione per 30 secondi. Un tasso di diluizione diverse possono essere introdotti anche in questa fase.
4. Pipettare una soluzione macchiato cellula di 10-100 microlitri tra coprioggetto o all'interno di un serbatoio microfluidica. Quindi, utilizzando una penna a vuoto (NT57-636, Edmund Optics), posto il campione sulla zona attiva di matrice di sensori.

RAPPRESENTANTE RISULTATI

Figura 2: (a sinistra) l'immagine raw di una miscela eterogenea contenente i globuli rossi, 10um, 5um e 3 particelle um. (Destra) completamente automatizzato LUCAS risultati di caratterizzazione per lo stesso campo di vista sono illustrati. Si noti che l'algoritmo di decisione è solido nel caratterizzare le regioni ad alta densità così come particelle con basso rapporto segnale rumore, come le perline 3um.

Figura 3: L'interfaccia LUCAS personalizzato è illustrato. LUCAS software basato su Java permette ingressi per le varie condizioni sperimentali, quali le dimensioni dei pixel del sensore o la lunghezza d'onda della luce. Selezione di uno specifico campo di vista l'immagine può anche essere fatte e gli schemi delle cellule bersaglio può essere definita dall'utente per costruire una biblioteca di statistica ombra delle cellule. L'immagine acquisita LUCAS possono essere caratterizzati sulla base di questi dati di formazione (ad esempio, la biblioteca ombra delle cellule) e la marcata (contati) immagine viene visualizzata per l'utente. Le statistiche dei risultati contano sono inoltre memorizzate in un file XML per ulteriori analisi.

Abbiamo mostrato che la piattaforma LUCAS può contare e identificare con precisione micro-objects/cells varie su un chip in base alla loro firma olografica, e fornisce uno strumento promettente per point-of-care diagnostica medica e high-throughput di biologia cellulare. Al fine di elaborare con precisione gli schemi registrato olografica, abbiamo implementato una custom-software sviluppato decisione LUCAS. Questo algoritmo, che utilizza un database di immagini di diffrazione statistica creata da formazione di immagini LUCAS, individua le varie caratteristiche di cellule all'interno di una soluzione eterogenea; classifica il tipo e la posizione relativa delle singole cellule e conta il tipo cellulare desiderato dopo l'applicazione della soglia di scartare particelle indesiderate / modelli di cellulare [1-3].

In sintesi, la piattaforma LUCAS dovrebbe fornire una soluzione conveniente e compatto per point-of-care citometria e della diagnostica medica. Per questo fine, LUCAS sarà particolarmente utile per il monitoraggio di pazienti HIV in contesti di risorse limitate come pure per altri problemi di salute globali connessi, come la malaria e la tubercolosi.