Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico

Aquí hablamos de los procedimientos experimentales que están involucrados en LUCAS [1-3]. Para ilustrar la prueba de concepto de LUCAS vamos a describir el proceso de imágenes para una muestra de sangre entera.

A. Imagen Set-up

La plataforma LUCAS imágenes muestra ventajas significativas para proporcionar una alternativa rentable y compacto a los actuales puntos de atención médica y la citometría de herramientas de diagnóstico, especialmente para entornos de recursos limitados. En lugar de detectar la imagen de las células, en lugar LUCAS capta hologramas digitales de las células que son creados por la interferencia de la luz dispersada por cada celda con la luz de fondo. El control cuidadoso de la coherencia parcial espacial de la iluminación es fundamental para activar la grabación holográfica.

1. Matriz de sensores digitales

La plataforma LUCAS utiliza una serie de sensores optoelectrónicos para grabar digitalmente los hologramas de celdas individuales. Para ello, los dispositivos de carga par (CCD, Modelos de la muestra: KAI-11002, KAF-39000, de Kodak) o complementary metal-oxide-semiconductor chips (CMOS, modelo de la muestra: MT9P031, Micron) se puede utilizar. Tamaño de píxel de la Kodak cargada dispositivos pareja, KAI-11002, KAF-39000, y sensores de imagen CMOS de Micron son de 9 m, m 6,8 y 2,2 micras, con un activo campo de visión de 10 cm2, 18 cm2, mm2 y 24,4, respectivamente. [1-2].

2. Fuente de luz

A diferencia de la mayoría de otras modalidades de imágenes microscópicas, LUCAS no requiere de un láser, por lo que incluso un simple diodo emisor de luz (LED) se puede utilizar para la iluminación. A fin de que la iluminación longitud de onda sintonizable, también podemos utilizar un monocromador con una lámpara de xenón (Cornerstone T260, Newport Corp.), junto con una fibra de sílice fundido de calidad estándar, que consiste en un haz de fibras (77.564, Newport) y orificio de ~ 100 m de diámetro situado en ~ 5-10 cm por encima de la superficie del sensor. Esta configuración de longitud de onda sintonizable iluminación ofrece una plataforma flexible, donde las firmas holográficas de las células puede ser ajustado, híbridos y firmas digitales pueden ser sintetizados para mejorar la relación señal-ruido para una precisión mejor caracterización y la especificidad. [3]

B. Preparación de muestras y de imagen

Una prueba de concepto de LUCAS basada en el chip de imagen se demostrará mediante una solución heterogénea como se describe a continuación. Un protocolo similar se podría aplicar a diferentes tipos de células [1-3].

1. Dilución de la sangre total y la preparación de la solución heterogénea

1. Para comenzar el proceso, obtener una muestra de sangre entera y microesferas de poliestireno de distintos diámetros (m 5, 10 y 20. Duque Científica), y llevar a todos a temperatura ambiente.
2. Añadir 2 ml de RPMI 1640 los medios líquidos clásicos (Fisher Scientific) como diluyente en un tubo de polipropileno estériles de 5 ml.
3. Después de incubar la muestra de sangre entera durante 30 minutos, pipetas hasta 10 l de la muestra de eritrocitos sedimentados y la transferencia en la solución de RPMI.
4. Añadir un volumen total de 20 microesferas de poliestireno l en los eritrocitos de dilución RPMI, y agitar la solución de células pipeteando con suavidad o mediante el uso de un agitador magnético con una barra agitadora.
5. Colocar un volumen total de 15.5 l solución heterogénea en una hoja de cubierta y colocar una hoja de segundo, la cobertura idéntica a la solución mediante el uso de fórceps. La muestra debe ser colocada entre los dos cubreobjetos de manera uniforme.
6. Luego, utilizando un lápiz de vacío (NT57-636, Edmund Optics) carga la muestra en la región activa de la matriz de sensores de imagen.

2. Manchas de sangre entera

1. Empezando con la preparación de una mezcla de 0,1% tamponado eosina y solución diluida de metileno nuevo mediante el uso de energía tipo puro Eosina Y (MW = 691,85, Acros Organics), libre de zinc puro Nuevo azul de metileno colorante (MW = 347,90, Acros Organics), y monohidrato de oxalato de potasio (99,0% de ACS reactivo, Acros Organics), cada solución se purifica con un tamaño de 0,45 micras de poro Syringless filtro (Whatman) para soluciones acuosas de tinción de células blancas en la sangre.
2. Luego, revuelva suavemente un reactivo disuelto manchas acuosas con la muestra de sangre entera en una proporción de volumen de 1:1 en un vaso de polipropileno mediante el uso de un agitador magnético durante 2 minutos y se incuba durante 10 minutos.
3. Transferencia de una solución manchadas de sangre de 50 L en un tubo de polipropileno de 5 ml y diluir con solución de RPMI 1640 classic líquido (Fisher Scientific) de 1,95 ml para adquirir una proporción de volumen de 1:200. Entonces, el vórtice de dilución durante 30 segundos. Una tasa de dilución diferentes también pueden ser introducidos en esta etapa.
4. Pipeta una solución células teñidas de 10-100 l entre cubreobjetos o dentro de un yacimiento de microfluidos. Luego, utilizando un lápiz de vacío (NT57-636, Edmund Optics), colocar la muestra en la región activa de la matriz de sensores.

Los resultados representativos

Figura 2: (izquierda) la imagen en bruto, de una mezcla heterogénea que contiene glóbulos rojos, 10um, 5 um y 3 partículas um. (Derecho) totalmente automatizado resultados de la caracterización LUCAS para el mismo campo de visión se muestran. Tenga en cuenta que el algoritmo de decisión es sólido en la caracterización de las regiones de alta densidad, así como partículas con baja señal a ruido, tales como las cuentas de 3 um.

Figura 3: La interfaz personalizada LUCAS se ilustra. Java permite el software basado en LUCAS insumos para diversas condiciones experimentales, tales como el tamaño en píxeles del sensor o la longitud de onda de la luz. La selección de un campo específico de vista sobre la imagen también se pueden hacer y los patrones de la célula diana puede ser definido por el usuario para crear una biblioteca de células sombra estadística. La adquisición de imágenes LUCAS puede ser caracterizado sobre la base de datos de este entrenamiento (es decir, la biblioteca de la sombra de células) y el marcado (contado) la imagen se muestra al usuario. Estadísticas de los resultados del conteo también se almacenan como un archivo XML para su posterior análisis.

Hemos ilustrado que la plataforma LUCAS precisión puede contar e identificar los diversos micro-objects/cells en un chip basado en su firma holográfica, y proporciona una herramienta prometedora para el diagnóstico de los puntos de atención médica y de alto rendimiento de la biología celular. Con el fin de procesar con precisión los patrones holográficos registrados, hemos implementado un software desarrollado a medida LUCAS decisión. Este algoritmo, que utiliza una base de datos de difracción de la imagen estadística creada por la formación de imágenes LUCAS, identifica diversas características de las células dentro de una solución heterogénea, clasifica el tipo y la posición relativa de las células individuales y cuenta con el tipo celular deseado después de aplicar el umbral para descartar las partículas no deseadas / patrones de células [1-3].

En resumen, la plataforma LUCAS debe proporcionar una solución rentable y compacto para citometría de puntos de atención y diagnóstico médico. Para este fin, LUCAS será especialmente útil para el seguimiento de los pacientes con VIH en entornos con recursos limitados, así como para otros problemas de salud mundiales relacionadas, tales como la malaria y la tuberculosis.