Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell'Organo murini di Corti.

Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. . J. Vis. Exp. (36), e1685, doi:10.3791/1685 (2010).

In tutti i mammiferi, l'epitelio sensoriale per audizione si trova lungo l'organo spirale del Corti che risiede all'interno della coclea conchiglia a forma dell'orecchio interno (fig. 1). Cellule ciliate della coclea sviluppo, che sono le cellule mechanosensory del sistema uditivo, sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre (nella base e la metà di giri) a quattro (nel giro apicale) file di cellule ciliate esterne che abbracciano la lunghezza del dell'organo del Corti. Cellule ciliate trasdurre vibrazioni meccaniche suono indotto della membrana basilare in impulsi nervosi che il cervello può interpretare. La maggior parte dei casi di sordità neurosensoriale sono causati dalla morte o la disfunzione delle cellule ciliate cocleari.

Uno strumento sempre più essenziale nella ricerca uditiva è l'isolamento e la coltura in vitro di espianti di organi ^1,2,9. Una volta isolato, il espianti possono essere utilizzati in diversi modi per fornire informazioni riguardanti normative, anomalo, o fisiologia terapeutico. Espressione genica, la motilità stereociglia, biologia cellulare e molecolare, nonché approcci biologici per la rigenerazione delle cellule dei capelli sono esempi di applicazioni sperimentali di organo del Corti espianti.

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo del Corti da topi neonati. Il video che accompagna include le direzioni a tappe per l'isolamento dell'osso temporale da cuccioli mouse e successivo isolamento della coclea, legamento spirale, e organo di Corti. Una volta isolata, l'epitelio sensoriale può essere placcato e coltivate in vitro nella sua interezza, o come un ulteriore sezionato micro-isola che manca la spirale limbo e dei neuroni del ganglio spirale. Usando questo metodo, gli espianti primari può essere mantenuta per 7-10 giorni. Come esempio dell'utilità di questa procedura, organo del Corti espianti sarà elettroporate con un gene esogeno giornalista DsRed. Questo metodo fornisce un miglioramento rispetto ad altri metodi pubblicato in quanto fornisce indicazioni riproducibile, senza ambiguità e graduale per l'isolamento, microdissezione, e la cultura primaria dell'organo del Corti.

Giorno 1. Sterilizzazione e rivestimento dei coprioggetto di vetro.

1. Secco sterilizzare coprioggetto microscopio vetro in autoclave.
2. Posizionare il coprioggetto sterilizzato in due pozzetti di una pre-sterilizzati quattro ben piatto di coltura cellulare.
3. Rivestire il coprioggetto con 1:1 poli-L-ornitina e laminina integrato con il 20% siero fetale bovino (FBS) notte a 4 ° C.
   1. 400 microlitri poli-L-ornitina (soluzione 0,01% conservati a 4 ° C)
   2. Laminina 400 microlitri (50 mg / ml soluzione stock conservato in aliquote a -20 ° C)
   3. FBS 200 microlitri (conservato in aliquote a -20 ° C)
4. Calore sterilizzare gli strumenti dissezione durante la notte in un 150 ° C incubatore.
5. Fai terreno di coltura contenente 10% siero e 10 mg / ml ampicillina.
   1. 90 mL di coltura Dulbecco modificato Aquila Media
   2. 5 FBS mL (conservato in aliquote a -20 ° C)
   3. 5 ml siero di cavallo (conservato in aliquote a -20 ° C)
   4. 10 L ampicillina (10 mg / ml soluzione madre conservato a 4 ° C)

2 ° giorno. Isolamento dei dell'organo del Corti.

1. Sterilizzare il positivo cofano dissezione flusso.
   1. accendere la luce UV per 20 minuti
   2. spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo e attendere 5 minuti prima dell'uso.
2. Decapitare il mouse cucciolo (P4) alla base del forame magno con le forbici operativo.
3. Brevemente lavare la testa in 10 piatti cm contenente etanolo al 70%.
4. Rimuovere l'epidermide con un bisturi.
5. Aprire il cranio lungo la sutura sagittale con una lama di bisturi e poi dividono in due la proencefalo. Conservare la proencefalo caudale per la dissezione ulteriormente.
6. Rimuovere l', cervelletto e tronco encefalico proencefalo con dissezione smussa.
7. Togliere le ossa temporali (fig. 2A), passarli brevemente in etanolo al 70%, e trasferirli in un piatto contenente 3 millimetri HBSS sterile.
8. Utilizzando pinze, rimuovere la bulla e il tessuto circostante dalla parte petrosa dell'osso temporale.
9. Individuare la conchiglia a forma di chiocciola (fig. 2B) e separarla dal sistema vestibolare con pinze.
10. A questo stadio di sviluppo, il labirinto osseo non è completamente calcificato ed è facilmente sezionato con pinze. Rimuovere il labirinto osseo della coclea per separazione attento a partire dalla fine basale e lo spostamento apicale con pinze.
11. Il legamento spirale e organo di Corti è collegato a spirale lungo la spirale del modiolus (fig. 2C). Rimuovere con attenzione dell'organo del Corti, garantendo il legamento spirale nella regione gancio della base con pinze e lo svolgimento come ci si sposta apicalmente.
12. Partendo dalla base, rimuovere il legamento spirale dalla dell'organo del Corti con una pinza sottile # 55 (fig. 2D).
    Micro-isolamento dell'organo di epitelio sensoriale Corti (opzionale).
13. Rimuovere l'organo del Corti regione gancio della base con due siringhe da insulina ½ cc con permanentemente attaccato U-100 28G ½ aghi pinze.
14. Partendo dal vertice, togliere la spirale limbus dalla fila di cellule ciliate interne e procedere basale (fig. 2E-F).
    Placcatura dell'organo del Corti espianto
15. Rimuovere la soluzione poly-L-ornithine/laminin/FBS dai pozzetti cultura e aggiungere 130 ml di terreno di coltura.
16. Trasferire l'organo di Corti sezionato al coprioggetto vetro rivestito nella cultura bene e orientare l'espianto in modo che le ciglia delle cellule dei capelli sono verso l'alto.
17. Rimuovere il supporto nella cultura e con una pipetta 200 microlitri. Assicurarsi che la membrana basilare entra in contatto solido con il coprioggetti vetro rivestito.
18. Aggiungere con cautela 130 ml di terreno di coltura per l'organo di Corti con una pipetta 200 ml. Applicare due gocce sulla superficie dell'organo del Corti e poi aggiungere lentamente il restante volume a lato del coprioggetto. Assicurarsi che l'organo del Corti non galleggia nei terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto.
19. Incubare per una notte a 37 ° C in presenza del 5% di CO _2.

3 ° giorno. Elettroporazione del gene reporter in organo colta di Corti.

1. Rimuovere il terreno di coltura dall'organo della cultura Corti.
2. Aggiungere 130 microlitri di H ₂ O per 1 minuto e poi rimuovere con una pipetta 200 microlitri.
3. Aggiungere 30 ml di giornalista DsRed plasmide (2 mg / mL H ₂ O conservati a -20 ° C).
4. Anticipo gli elettrodi del elettroporatore utilizzando un micromanipolatore in modo che l'anodo unocatodo ° sono su entrambi i lati della cultura.
5. Generare un impulso (27V, 30 ms di durata, 10 treni di impulsi) per electroporate il gene reporter nell'organo della cultura Corti espianto.
   1. Opzionale: invertire la polarità dell'impulso per garantire elettroporazione del transgene su entrambi i lati e modiolar spirale legamento del espianto.
6. Attendere 5 min.
7. Aggiungere 130 microlitri della Fugene 6: soluzione di DNA (3 parti Fugene a 2 parti di DNA). Questa soluzione deve essere preparata prima dell'inizio della procedura di elettroporazione (passo 20) con un rotondo 3 ml fondo in polistirene di prova in una cappa a flusso laminare. Per rendere questa soluzione:
   1. Aggiungere 2,4 ml di Opti-MEM (conservato a 4 ° C) per la provetta.
   2. Aggiungere 0,6 ml di reagente Fugene 6 (conservato a 4 ° C) per la provetta. Assicurarsi di aggiungere il Fugene direttamente al Opti-MEM ed evitare il contatto diretto con i lati della provetta.
   3. Vortex per 1 secondo.
   4. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 2,0 microlitri DsRed giornalista plasmide DNA a doppia elica (conservati a -20 ° C a 100 DNA mg / ml aliquote H ₂ O).
   6. Vortex per 1 secondo.
   7. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
   8. Aggiungere 200 ml di terreno di coltura.
   9. Vortex per 1 secondo.
8. Incubare per una notte a 37 ° C in 5% di CO _2.
9. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura alla cultura bene e incubare per 37 ° C per un massimo di 10 giorni.

Rappresentante Risultati

Vi presentiamo un metodo per l'isolamento dell'organo del Corti da un mouse perinatale. La procedura può essere utilizzata per topi giovani come il giorno embrionale 16 fino a circa 6 giorni dopo la nascita, momento in cui il labirinto osseo diventa sufficientemente calcificate a rendere la dissezione ingombrante. Una volta che l'organo del Corti è sezionato, può essere placcato e colto nella sua interezza (fig. 3) o come micro-isolati epitelio sensoriale (fig. 4). Abbiamo inoltre presentato una tecnica di esprimere geni esogeni nell'organo colta di Corti. La cultura organotipica è utile per molti altri tipi di studio, come l'analisi di organo del Corti genica mediante RT-PCR o ibridazione in situ, organo del Corti co-coltura con cellule gangliari a spirale o cellule staminali esogene utilizzando il micro-isolare ^3, o in analisi in vitro di morte delle cellule e la rigenerazione dei capelli.

Figura 1. Sezione dell'organo P4 murino di Corti. (A) Una sezione trasversale a cavallo basale di una coclea cryosectioned ottenuto da un topo P4 illustra le strutture generali della coclea murino descritto in questo protocollo. I media scala è delimitato dal legamento spirale e stria vascularis lateralmente, la membrana del Reissner s superiormente, la spirale limbus medialmente, e la membrana basilare inferiormente. La casella indicata la regione espansa in B. (B) L'organo del Corti si trova sul lato superiore della membrana basilare e comprende una fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne, e le loro rispettive cellule di sostegno. Linea tratteggiata 1 indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante questo organo di dissezione Corti. 2 linea tratteggiata indica la posizione lungo la membrana basilare che viene rimosso durante la micro-procedura di isolamento. Verde indica l'etichettatura di immunoistochimica calbindin, che le etichette le cellule del limbus interdentale spirale, le cellule ciliate cocleari, i neuroni del ganglio spirale, così come le cellule del legamento spirale e vascularis ⁷ stria. DAPI etichettatura dei nuclei è in blu.

Figura 2. Organo di dissezione Corti. Immagini dal video che accompagna l'organo di evidenziare dissezione Corti A) il sistema di coclea e vestibolare situato all'interno dell'osso temporale isolato (rosso), B), il labirinto osseo della coclea, C) il legamento spirale e collegato organo del Corti dopo la rimozione del labirinto osseo, D) la rimozione del legamento spirale e stria vascularis (rosso) dal dell'organo del Corti, E) micro-isolamento dell'epitelio sensoriale dal limbo spirale (rosso), e F) il isolato spirale limbus (a sinistra) e l'epitelio sensoriale (a destra).

Figura 3. Colta organo di Corti espianto. DIC immagine che mostra l'organo diCorti di un Atoh1-nGFP topo P4 che è stato isolato, placcato, e colto per cinque giorni come descritto. Questo mouse è stato geneticamente modificato in modo che le cellule che esprimono la pro-capelli genica su cellule omologo Atonal 1 (aka Atoh1 Math1) mostrano una proteina verde fluorescente che è localizzato al nucleo ^8. Gli organi di Corti da questi topi presentano un'etichetta nucleare GFP in tutti i nuclei delle cellule dei capelli e quindi permettono una facile visualizzazione dell'epitelio sensoriale utilizzando un microscopio epifluorescente. La relativamente grande spirale limbus può essere vista laterale per l'epitelio sensoriale. Cellule mesenchimali che hanno avuto origine dalla dell'organo del Corti sono emigrati lontano dal espianto. Blue Label nucleare è DAPI.

Figura 4. Micro-isolati epitelio sensoriale. Epifluorescente immagine ottenuto dal epitelio sensoriale che è stato isolato da un organo P4 murino di Corti come descritto e colto durante la notte. Il micro-ceppo è stato poi fissato nel 4% paraformaldeide e trattati per immunomarcatura della 7a miosina che le etichette cellule ciliate cocleari. Si noti l'assenza della spirale limbus comparativamente più dalla figura 3. Blue Label nucleare è DAPI.

Figura 5. Elettroporazione del gene reporter di DsRed nell'organo colta di Corti. Interi organi di Corti da P4 Atoh1-nGFP cuccioli di topo sono state isolate, placcato, e poi elettroporate con il gene reporter DsRed come descritto e quindi visualizzati sotto un microscopio epifluorescente. Cellule dell'organo di espianto Corti che hanno espresso la proteina transgenica giornalista DsRed cellule mostrano una fluorescenza rossa e endogena della mostra epitelio sensoriale una fluorescenza verde nucleare. Cellule transgeniche possono essere visti in tutto il limbus a spirale ed epitelio sensoriale.

Ci sono molti dettagli che sono fondamentali per il successo di questa procedura. Minore è il tempo dall'isolamento osso temporale per organo di incubazione Corti, maggiore è la possibilità che gli organi che attribuirà alla coprioggetto e risultato nelle culture degli organi vitali. Pertanto, è importante limitare la quantità di tempo che intercorre tra la dissezione e l'immissione degli organi nell'incubatrice. La scelta dell'antibiotico è cruciale, dato che molti antibiotici aminoglicosidici sono ototossici e può provocare la morte delle cellule dei capelli. Anche se è preferibile rinunciare all'uso di antibiotici del tutto, questo lascia aperta la possibilità di contaminazione. Pertanto, si consiglia l'uso di 10 mg / ml ampicillina come regola generale per superare problemi di contaminazione potenziale.

L'aspetto più fastidioso di questa, e altre procedure per la coltura primaria dell'organo del Corti, è la tendenza degli organi di galleggiare fuori i piatti durante l'incubazione. Anche se le culture organo galleggiante possono rimanere vitali per 5-7 giorni, ci sono svantaggi di organi coltura galleggiante. Per esempio, culture d'organo galleggiante spesso piega su se stessi dopo 4-5 giorni di rendering microscopia problematico. Successivamente, l'integrità strutturale di un organo può diventare compromessa rispetto agli organi che sono stati apposti i coprioggetto. Abbiamo scoperto che le seguenti tecniche contribuirà ad assicurare che l'organo del Corti non galleggia in terreni di coltura, ma rimane apposta sul coprioggetto. In primo luogo, cappotto coprioggetto il vetro in 1:1 polyornithine / laminina integrata con 20% FBS come descritto. La notte di incubazione previsto dal presente protocollo è il tempo minimo che il piatto deve essere rivestita. Nel nostro laboratorio, abbiamo spesso strato tutti i piatti di cui abbiamo bisogno per una settimana e tenerli a 4 ° C fino al giorno prima dell'uso quando li passare al incubatore per una notte di incubazione. In secondo luogo, dopo che gli organi sono trasportati al coprioggetto rivestito, orientare l'espianto in modo che le ciglia delle cellule ciliate a faccia in su. Questo orientamento facilita l'aderenza della membrana basilare per il piatto cultura. In terzo luogo, rimuovere il supporto all'interno del pozzo di apporre l'espianto al piatto rivestito. Questo garantirà il contatto tra il piatto della cultura e della membrana basilare e migliorare la capacità del espianti di aderire al vetro. Ciò contribuirà anche a mantenere l'integrità strutturale del file di cellule ciliate. Infine, attenzione a goccia 2 gocce di terreno di coltura sulla superficie dell'organo del Corti con una pipetta 200 microlitri capacità e poi, lentamente, riempire il pozzo da gocciolamento del volume residuo (del totale 130 mL) sul lato del coprioggetto. E 'importante lavorare rapidamente per assicurare l'attaccamento dell'organo del Corti alla coprioggetto rivestito. Dalla data di apertura della dissezione per l'incubazione del espianti, che in genere dura 10 minuti per un operatore praticato per completare questa procedura di isolamento organo di Corti.

In questo protocollo, si presentano anche un metodo per la micro-isolamento dell'epitelio sensoriale dal limbo spirale dell'organo del Corti. In questa procedura, il limbus spirale è sezionato dalla epitelio sensoriale utilizzando aghi 28G ½ insulina come strumenti di dissezione. La risultante micro-isolare costituito le file di cellule ciliate e le corrispondenti celle di supporto (fig. 3). L'epitelio sensoriale isolato può essere colto come descritto in questo protocollo. Questo micro-isolamento procedura deve essere confrontata con la separazione enzimatica degli epiteli sensoriali dal tessuto circostante ^4. Nei mammiferi, così come non-mammiferi specie come polli, digestione thermolysin di isolati risultati vestibolare organi nell'isolamento degli epiteli sensoriali dalle cellule mesenchimali seminterrato ^4. Nel ratto coclea, i risultati digestione thermolysin nella separazione della cresta epiteliale maggiore, minore cresta epiteliale e di accompagnamento epiteli sensoriali dalla membrana basale ^5. Tuttavia, non è chiaro se l'epitelio sensoriale cocleare possibile allegare alle piastre di rivestimento senza l'accompagnamento delle cellule mesenchimali. Mentre sia la micro-meccanica e di isolamento metodo enzimatico risultato metodo della digestione, la separazione degli epiteli sensoriali dal limbo spirale, i vantaggi della micro-dissezione isolare il digestione thermolysin includere un protocollo relativamente più brevi, meno costosi reagenti, e lo stress potenzialmente meno di l'espianto a causa degli effetti della digestione enzimatica. Inoltre, la membrana basale è lasciata intatta in questo approccio, che può aumentare l'attaccamento dell'epitelio sensoriale alla piastra di coltura. Gli svantaggi di questo metodo comprendono la necessità di sviluppare le competenze di questa delicata dissezione e potenziali danni meccanici per l'epitelio sensoriale derivante dalla dissezione micro.

Come esempio dell'utilità di questa procedura, si presentano anche un esempio dell'uso dell'organo diCulture Corti, l'elettroporazione di geni esogeni nella cultura espianto. La procedura sopra descritta elettroporazione si basa su precedenti metodi di elettroporazione organo del Corti. In particolare, Zheng e Gao (2000) descrivono l'elettroporazione di organi isolati di ratto delle Corti dove si svolgono le espianti in vigore per l'elettroporazione di una scanalatura di costruzione della agarosio e poi placcato sul collagene rivestito 8-scivolo LabTek bene in mezzo privo di siero ^2. Un vantaggio di questo approccio è che gli organi sono orientate in modo che la superficie superiore del espianti faccia il catodo, che teoricamente dovrebbe portare a una distribuzione uniforme delle cellule elettroporate attraverso l'espianto. Nelle nostre mani tuttavia, il metodo che descriviamo migliorato su questa procedura perché l'organo del Corti è rimasto apposta sul coprioggetto durante tutta la procedura in modo da ridurre la manipolazione degli espianti dopo l'elettroporazione. Inoltre, una percentuale più alta di organi di Corti rimasta unita al copri con questo metodo presentato. Il nostro metodo è tratto da Jones et al. (2006) che utilizza l'aggiunta della Fugene 6 reagente per aumentare l'efficienza di espressione genica dopo l'elettroporazione. Nel Jones et al. (2006) il protocollo, gli organi sono elettroporate, incubate per 5 minuti con 100 ml di Fugene 6 reagenti di trasfezione, e placcato ^6. Il nostro metodo si differenzia per l'uso di un rapporto 3:2 di Fugene 6 reagente al DNA plasmide, che abbiamo trovato empiricamente per fornire ottimale espressione transgenici con minima tossicità d'organo. Non usiamo puro Fugene 6 reagente, il che può causare tossicità per le colture. La configurazione degli elettrodi nel nostro protocollo, così come Jones et al. (2006), si traduce in espressione genica primario sia la spirale limbus o epitelio sensoriale a seconda della posizione del catodo. Anche se ci sono DsRed cellule positive sul versante della cultura distante verso il catodo, vi è una maggiore concentrazione di cellule transgeniche più vicino al catodo. Per assicurare una completa espressione del transgene in entrambi i lati dell'organo del Corti espianto, la corrente può essere invertita per un treno di impulsi secondo semplicemente invertendo i cavi. I risultati presentati in protocollo l'espressione del transgene robusta in tutto l'organo del Corti (fig. 5).

Gli autori desiderano ringraziare Demêmes Danielle e Douglas Cotanche e per il loro impegno nella didattica noi i metodi per l'isolamento di dell'organo del Corti. Inoltre, vorremmo ringraziare Ismaele Stefanov-Wagner per la progettazione degli elettrodi elettroporatore; Sherry Lin per le sue opere d'arte che contribuiscono alla animazione video, e Matteo Chana, Jason Meeker, Kendra e Marshall ( www.goodfightproductions.com ) per la produzione del video. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni (R03DC010065-Parker; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI supporto di base per Hearing Research) dal dell'NIDCD.

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