遺伝子誘導の運命のマッピングへの実践的アプローチ：マークとトラックの細胞へのビジュアルガイドインビボでの

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine, Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine, Brown University

タモキシフェンの準備と強制経口投与手順（E8.5）

• 予め温めておいたコーン油にタモキシフェンを溶解することによりタモキシフェンの20 mg / mlのストック溶液を調製。
• 37ソリューションをインキュベート° C nutatorと断続的にボルテックスで2時間。
• 4の光、店舗° Cからタモキシフェン株式を保護し、一ヶ月までに使用。
• と遺伝子特異的クリアー^T対立遺伝子とレポーターの対立遺伝子の両方を運ぶ男性の、運命のマッピングの実験のために、スイスウェブスター女性（タコニックから購入した野生型）で構成される繁殖のペアを確立する。 MGFP男性（Ellisor 2009）、デモンストレーションの目的のために、我々はWnt1 -クリアー^Tを使用^しています。
• 膣栓の外観のために毎朝スイスウェブスターの女性を確認してください。膣栓が0.5日後に性交と見られている日の朝（0900）を指定し、この出発点に基づいて、タモキシフェン投与の日付を計算する。 （この実験では、胎生8.5が使用されていた）。
• タモキシフェンのストック溶液（4 mgのタモキシフェン）の200μlを描画するために動物給餌針（20G X 1-1/2）1 mlシリンジを使用してください。
• しっかりと首の首筋をつかんで、時間妊娠スイスウェブスターの女性を抑制し、後頭部を固定し、腹側が上を向いているように裏返しますする。
• 直線でボディを保つために無料の指の間に尾を保持する。
• 口の端に送り針を置き、ゆっくりと口の屋根に沿って針を導く。
• それは首をまっすぐに戻すと同時に傾斜ヘッドながら、ボディと平行になるように針を回転させる。
• 胃に向かって、食道の下方に針を導く。気管を入力しないように注意してください。針の抵抗、動物の咽頭反射が作動、またはマウスが闘争場合がある場合は、直ちに針を削除し、再度強制経口投与をしてみてください。
• 送り針が胃になると、胃にタモキシフェンを投与し、解剖の日まで彼女の家のケージにメスを返します。

開頭術：

• Intracardially 4％PFAで成人の運命マッピングされたマウスを灌流し、ちょうど肩の上に脊柱を介してカットしてハサミで頭部を削除します。
• 頭皮を切ってとスカルを公開するために、頭（尾に尾側）の背側正中線に沿ってメスを実行します。
• メスを使用して、頭蓋骨の側面と後部に沿ってから余分な組織や筋肉を削り取る。
• 鉗子、穿刺だけで嗅球への吻側と細かいハサミの先端に対応するために小さな穴を作成正中線で頭蓋骨を持つ。
• この穴に素晴らしいはさみを挿入し、嗅球の外側約長さの切開を内側にします。このカットは、鼻の骨や前頭骨の交差点で頭蓋骨を切断し、はさみのための良好なアクセスを提供します。
• 基盤となる組織の損傷を防ぐために、離れて脳からの角度、はさみのヒントをように注意しながら頭蓋骨の矢状縫合（背側正中線）に沿ってカット。
• ゆっくりと鉗子と皮離れて脳を露出させる内側の切開に沿って骨と頭蓋骨を把握する。頭蓋骨が小さな部分で、オフチップ以上のセクションに離れて壊れる可能性があります。前頭葉、頭頂葉、頭頂間、および後頭の骨のすべてを削除するには、鉗子を使用し続ける。
• 両側に球状の骨をつまんでparaflocculiを（小脳のレベルでの脳の側縁に沿って位置）包む骨をクラック。ゆっくりと骨を引き離します。
• 上下逆さまに頭を回して（下に背側）と脳神経を切断し、頭蓋骨から脳を解放するために鉗子を使用する。

全体のマウント顕微鏡：大人の脳

• GFPは、蛍光解剖スコープを使用してマーキングするために成人の脳を評価する。
• PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に脳を転送する。

全体のマウント顕微鏡：E12.5胚

• 蛍光解剖スコープを使用してGFPマーキングのための全体のマウントの胚を評価する。
• PBSとPictureFrameまたは他の適切なソフトウェアを使用して写真を含むペトリ皿に全部マウントして正のGFPであるものを転送します。
• 各胚から尾の小片をオフに挟まないように鉗子を使用して、組織全体のマウント解析から見たときの結果を確認するために、両方の対立遺伝子のPCR（Ellisor 2009）を使用してPCRチューブおよび遺伝子型の各ピースを置きます。

顕微解剖およびE12.5胚から腹側中脳の外植片の準備

• 子宮チェーンとIDから解剖以下ホールマウント蛍光、細胞培養皿の氷冷滅菌PBSに転送胚によって運命にマップされた胚のentification。
• 細かいハサミを使用して、rhombomere 1〜尾横切断胚の頭部の部分を、削除してください。
• 次に、間脳を介して冠状カットで頭の吻側部を削除してください。これは、背側と腹側の組織の間の導管中脳胞の形態を通じて第四脳室にチューブ状の構造を公開します。
• 慎重に、"オープンブック"の準備を作成し、完全にチューブを開いて、吻側に尾側、背側正中線に沿ってはさみ第四脳室へのヒント、およびスニップを挿入します。中脳の二つ背側半分が横方向に配置される間、腹側中脳は、現在、内側に公開されます。
• もっときっぱりとレイアウトする組織のためのために、腹側中脳の下に残りのすべての非神経組織を削除します。なる必要がある場合は、外植片の背側"翼"だけでなく、平らになりますように吻側および尾側の面にノッチを作る。外植片は、今、"背側中脳の翼を表している蝶、、とrhombomere 1尾のようになります。
• さらにFACS解析や細胞培養実験の腹側中脳を単離するために、組織の外側（背側面）を取り外します。

代表的な結果：

このGIFM実験では、Wnt1発現細胞は永久にとheritably E8.5にWnt1 - CreERTでタモキシフェンを投与することにより、胚発生中にマークされています。MGFPの胚。その後、これらの顕著な細胞はWnt1由来細胞は、開発全体の神経構造に貢献する方法を決定するために全体のマウントの蛍光とセクション免疫組織化学を介して可視化しています。全体のマウント蛍光はMGFPレポーターの膜結合型GFPのコンポーネントに依存し、従って細胞の情報だけでなく、Wnt1由来神経突起の包括的なビューを提供します。主に中脳、後脳後部と脊髄でのE12.5展示GFPの蛍光でE8.5、Wnt1 - CreERTmGFP胚（図1A）でのタモキシフェン投与で、例えば。高倍率で、微細な神経細胞の突起は、中脳、体壁、四肢、および頭蓋顔面領域の神経支配見られている。この発達段階では、胚が透明で、内部のGFP標識は容易とに識別です。しかし、脳の発達として、成熟した組織の密度は、内部の脳の構造から発生するGFPの蛍光をあいまいにしています。したがって、E8.5でのタモキシフェン投与で、わずかなGFP標識は、全体のマウント蛍光（図1C、はめ込み）による成人の上丘で観察される。また、一部の軸索突起（図示せず）後脳の腹側表面に沿って走ること見られている。これとは対照的に、タモキシフェンがE9.5で投与されている場合、実質的なGFP標識は、全体の下丘（図1B、挿入図）を通じて行われます。全体のマウントの蛍光の増加は、E9.5でWnt1発現細胞は背側中脳の表面的な地域に、より大きく寄与するまたはE8.5からWnt1発現細胞よりも、この領域内に複数のプロセスを拡張することを示している可能性があります。関係なく、全体のマウントでこの違いは、蛍光は開発中のWnt1発現の動的な性質を反映しており、GIFMが成熟した大人に胚から別個の細胞集団を追跡するために使うことができる方法を示しています。

Wnt1 - CreERTから免疫組織化学、運命マッピングされた組織切片で、MGFPの動物は、細胞レベルで分析される。 GFP、β-ガラクトシダーゼ（β- gal）に対する抗体は、神経構造と細胞タイプへWnt1系統の微細細胞の寄与を決定するために組織特異的バイオマーカーの様々な組み合わせで使用されています。 E12.5においてE8.5でのタモキシフェン投与と組織の分析で、二重陽性細胞（GFP +とβ- galを+は）腹側中脳（図1B）を介して走ることの突起を持つ中脳と後脳全体に観察される。成人の脳で、E8.5でマークWnt1系統は腹側被蓋野のドーパミン作動性細胞集団の近くでだけでなく、優れたと下丘を含む多くの脳の構造を生じさせると黒質（図1D）（参照してくださいまたゼルバス2004）。対照的に、E9.5でマークWnt1 -系統は、ドーパミン作動性細胞集団（図1F）の近傍のニューロンにだけでなく、下丘を生じさせる。

図1 Wnt1 -運命のマッピングのための代表的な結果。：

MGFP胚及びE8.5（AD）で（マーク）マップされた成人の脳の運命、ホールマウントとWnt1 - CreERTにおける免疫細胞化学結果の例とE9.5（EF）。 A. Wntシグナル1 -クリアー、主に中脳でのE12.5展示GFPの蛍光でMGFP胚（MB）、後方後脳（ヘモグロビン）と脊髄（Sp）を。 B.マーク細胞が可視化し、この1 -μmの厚さの光学部（40倍目標、Zシリーズの買収）に示すように、免疫組織化学により細胞レベルで分析した。 （nβ- gal）のβ-ガラクトシダーゼ核抗体標識（赤）とGFPの抗体標識（緑）は腹側中脳に示すように運命にマップされた細胞を示す。ここでは、組換え細胞がため、条件付きMGFPレポーターの性質の（nβ- GAL + / GFP +）ダブルポジティブです。 C.ホールマウント蛍光顕微鏡では大人の上丘（SC）（挿入図）でのかすかなGFPの蛍光を明らかにする。低倍率（5倍）顕微鏡で大人のセクションでE8.5でマークWnt1系統の評価は、Wnt1の系統が（IC）（SC）スーペリア、下丘（C）を含む中脳の構造を生じさせることがわかります。 D.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 E.は、容易に全体のマウント蛍光（挿入図）で中脳の下丘で観察される実質的なGFPの標識E9.5の結果でマーキング。低倍率（5倍）顕微鏡（E）で見られるような大人のセクション（β- galの+、赤）にE9.5でマークWnt1の系統は、下丘（背後部中脳）に集中している。 F.nβ- GAL +細胞と豊富なGFP +軸索神経叢とのドーパミン作動性ニューロンの近傍の腹側中脳から採取した40倍速、1ミリメートル光学部。 Wnt1の系統は腹側中脳への貢献に持続する間E8.5対E9.5でマークWnt1由来のニューロンが徐々に、背側中脳への貢献を制限されます。