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KLRG1四聚体的生产协议

, ,

Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University

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Cite this Article: KLRG1四聚体的生产协议

Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L. A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701, doi:10.3791/1701 (2010).

Abstract: KLRG1四聚体的生产协议

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是II型跨膜糖蛋白抑制性受体，属于C型凝集素样超家族。 KLRG1存在单体和二硫键相连的二聚体。这种保守的受体上最成熟，最近激活NK细胞，以及效应/记忆性T细胞的一个子集。

使用KLRG1四聚体，以及其他的方法，E，N，和R -钙粘素被确定为KLRG1配体。这些CA 2 +依赖的细胞，细胞粘附分子由胞外域包含五个cadherin的细胞间的相互作用，跨膜结构域和细胞质域与肌动蛋白细胞骨架的重复。

KLRG1四聚体的生成，是必不可少的KLRG1配体的识别。 KLRG1四聚体，也是一个独特的工具，以澄清在调节免疫反应和组织的完整性的作用cadherin和KLRG1发挥。

Protocol: KLRG1四聚体的生产协议

包涵体的制备

  1. 接种4 × 500毫升烧瓶结核病每个过夜培养的细菌，表达KLRG1质粒构建含有50微克/ ml的羧苄青霉素和氯霉素。当外径达到0.6 A，在600 nm与0.4 M IPTG诱导，并在37孵育一个附加的4小时晃动文化° C。
  2. 中提取的干细胞重悬在再悬浮缓冲液的pH值= 8.0（50 25％（W / V）蔗糖，1 mM的EDTA，MM的Tris - HCl，10 mM的数码地面电视）。注：颗粒可以在这个阶段被冻结。
  3. 池不超过60毫升细菌resuspensions的聚丙烯烧杯。如果有必要调整到60毫升，用TE缓冲液pH值8.0，并在半速搅拌混合。
  4. 以搅拌混合添加下降明智的：溶菌酶（终= 1毫克/毫升），氯化镁（终= 5毫米），2毫克DNA酶我包含在50％的甘油75毫米氯化钠，TRITON - X100（最终= 1％），数码地面电视（最终= 10毫米）。
  5. 超声冰1.5分的解决方案，并在10分钟5000转离心裂解液在4 ° C。
    1. 倾倒上清液。
    2. 添加15毫升的洗涤缓冲液的pH值= 8.0（50毫米的Tris - HCl，0.5％Triton X - 100的的氯化钠，100毫米，1毫米EDTA，1 mM的数码地面电视）。
    3. 在冰上，超声1.5分钟的解决方案，直到沉淀完全重悬。
    4. 10分钟5000转离心样品在4 ° C。
    5. 重复洗5次。
  6. 洗没有TRITON X - 100，离心机和4毫升TE缓冲液中的悬浮缓冲液重复5B。
  7. 以湿重包涵体浆在30至100毫克/毫升的浓度，并存储在TE缓冲液。

复性KLRG1

  1. 1 L复性缓冲液pH = 8.0（0.4 M精氨酸盐酸的0.1 M Tris pH值8-8.3，2毫米EDTA，0.2毫米PMSF，EDTA - 免费蛋白酶抑制剂药片，5毫米GSH和0.5毫米的GSSG）和寒意到4 ° C，边搅拌。
  2. 准备注入折叠混合物包涵体：这是非常理想，使每5 10注射用0.25 0.5微米的浓度，使终浓度的蛋白质将于2 3微米。
    1. 融化10毫米的β-巯基乙醇50毫克包涵体浆量在7米GnHCl。
    2. 保持包涵体/ GnHCl混合物在37 ° C为30 - 40分钟和涡每5分钟，以确保完全融化（完全融化时，泥浆就会清楚）。
    3. 离心机最大速度离心30分钟在4 ° C，将上清转移至15 mL离心管。做不转让任何黑色的小颗粒。
  3. 注射缓冲液（3米GnHCl，10毫米NaAcetate mM的EDTA，pH值4.2,10），调整音量。
  4. 注入1毫升稀释后的包涵体每隔一小时。注射时，在高速搅拌，添加1毫升稀释包涵体下降，下降2秒之间每下降。当注射完成后，在低速搅拌。
  5. 隔夜继续低速搅拌，在4 ° C。

浓度的复性反应

  1. Millipore公司S协议，集中1升的预过滤（0.22μm的过滤），复性反应使用Amicon搅拌细胞和YM10 NMWL 10K超滤膜（Millipore公司）〜10毫升。
  2. 集中≤2毫升，使用一个Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。

KLRG1四聚体的纯化

  1. 安装在4 ° C，符合GE医疗手册的AKTAFPLC。
  2. 使用Sephacryl S - 200 16/60高分辨率柱（通用电气医疗集团）在20毫米的HEPES和150 mM氯化钠尺寸排阻色谱纯化单体形式存在的KLRG1。 （见图1）。
  3. 浓缩至1 ml，使用Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。
  4. 根据以亲和力S协议，使用比拉酶biotinylate KLRG1单体。
  5. 免费素是体积排阻色谱2淘汰。
  6. KLRG1分子tetramerized KLRG1单体与4倍超额摩尔聚乙烯共轭链霉亲和素（BD Biosciences公司）混合。

代表性的成果

图1
AKTA FPLC尺寸排阻色谱图1。代表从积极的成果复性KLRG1。图表显示分离（83.52毫升）的单体，二聚体（56.36毫升），和multimer（36.26毫升）的复性KLRG1形式。 94.25毫升峰代表缓冲区交换。

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Discussion: KLRG1四聚体的生产协议

在这个协议中，它是如何净化，biotinylate，tetramerize KLRG1。 KLRG1四聚体可以用来标记流式细胞仪KLRG1配体。虽然复性条件进行测试，每个蛋白质的经验，其他的C型凝集素可tetramerized使用了类似的协议。使用tetramerized蛋白作为探针，对孤儿的C型凝集素受体的配体可能被确定。

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Disclosures: KLRG1四聚体的生产协议

Acknowledgements: KLRG1四聚体的生产协议

我们感谢博士Naidenko优化复性条件的帮助。这项工作是支持由美国国立卫生研究院的研究经费AI58181洛朗Brossay。辛迪迪班是由美国国立卫生研究院NRSA F31 AI080230支持。

斯蒂芬妮Terrizzi和辛迪迪班平等作出贡献，对这项工作。

Materials: KLRG1四聚体的生产协议

Name Type Company Catalog Number Comments
BirA Enzyme and Buffer Biotinylation Kit Avidity BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free Reagent Roche Group 11 836 170 001 or equivalent
Amicon Stirred Cell Equipment EMD Millipore Model #8400 or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane Filtration Supply EMD Millipore 13642
15 ml YM10 concentrator Filtration Supply EMD Millipore 4411
AKTAFPLC Equipment GE Healthcare 18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column Equipment GE Healthcare 17-1166-01
Strepavidin PE Reagent BD Biosciences 554061 or equivalent

References: KLRG1四聚体的生产协议

  1. Tessmer, M.S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O.V., Chong, H.J., Leclercq, G. & Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol 19, 391-400 (2007).
  2. Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K.F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M.F. & Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol 176, 1311-1315 (2006).
  3. Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K. & Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med 203, 289-295 (2006).
  4. Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L.K., Pircher, H. & Mariuzza, R.A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity 31, 35-46 (2009).
  5. Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N. & Maenaka, K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem, in press (2009).

Ask the Author: KLRG1四聚体的生产协议

2 Comments

Hello, I'm Kyungeun Kim, postdoctoral fellow at MD Anderson. Your protocol is very helpful to me. By the way.. Is this tetramer useful for blocking a interaction between KLRG1-expressing cell and their ligand-expressing cells to reduce KLRG1 signaling? Thank you.

1

Reply

Posted by: Kyungeun KimApril 14, 2010, 12:18 PM

Hi Kyungeun, thanks for the note, we did some experiments like that but it was not conclusive

1.1

Reply

Posted by: Laurent B.April 14, 2010, 1:57 PM

Hello, I am the new guy to protein purification and refolding. Your visualized protocol help me a lot in setting up my own experiment. I have a small question, what is the purpose of the Inject buffer when dilute inclusion bodies into refolding buffer. I also notice that some other protocols (as www.microbiology.emory.edu/altman/jdaWebSite_v3/p_tetFolding.shtml) have a slight different injection buffer recipe in the concentration of GnHCl(3mM). And another question, Did the amount of inject buffer add into inclusion bodies/GnHCl mixture affect the refolding results? Thanks Lu Yi from China

2

Reply

Posted by: Lu YiNovember 12, 2010, 3:28 AM

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