Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

1, 1, 2, 2, 1

1Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, 2Anatomy and Developmental Biology, Monash University

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 107.22.156.205, User IP: 107.22.156.205, User IP Hex: 1796644045

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis. J. Vis. Exp. (35), e1707, doi:10.3791/1707 (2010).

Abstract: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Undecalcified kemik histolojisi kemik mikro-mimari göstermektedir. Bu mineralize kemik, kemik döngüsü ve kemik yapım ve yıkım ile ilgili önemli bilgiler sağlar ve hücresel bileşenleri gösterir. Bu, klinik ve araştırma uygulamaları çeşitli büyük bir öneme sahiptir. Çok güzel görüntüler 1 verim ve florokrom değerlendirme ve histomorfometri 2 gibi teknikler sağlar. Florokrom analizi, o bir zamanda mineralizasyon miktarı ölçümü için sağlar belirli bir zaman noktasında, kalsiyum bağlamak floresan boya enjekte edilir bir tekniktir. Histomorfometri mikroskobik düzeyde kemik nicelikleme bir süreçtir.

Undecalcified kemik histolojisi Sahne teknik özellikle büyük boyutlu örnekleri zordur. Histoloji gömülü standart parafin kullanılan bu tekniği farklılıklar gerektirir. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir. Genellikle birkaç hafta Ancak, yoğunluk ve düşük kemik geçirgenliği oldukça uzun fiksasyon ve işlem süreleri gereklidir nedeniyle diğer yumuşak dokularda benzer bir şekilde, numune hazırlama, fiksasyon ve işlenmesi ile elde edilir. Gömme metakrilat esaslı reçineler gibi kemik, benzer ya da eşit sertlik ve yoğunluk ile destekleyici bir ortam kullanılarak, ancak elde parafin infiltrasyon ve gömme aksine, bu geri dönüşü olmayan bir bir adımdır. Kesit florokrom analizi gibi çalışmalar için en uygun kalın bir bölümü, üretir öğütülmesi ile elde edilebilir. Bu iyi bir macrotome bir elmas bıçak kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, ince kısımların ışık mikroskobu için üretilen ve bu çok keskin bir bıçak ile bir kızak mikrotom kullanılarak elde. Kızak mikrotom büyük, sert bloklar için gerekli ek güç ve kararlılık sağlar. Reçine gömülü gösterilmektedir lekeleri çeşitli bölümleri ile boyanmış olabilir.

Protocol: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

  1. Dokusu,% 10 fosfat içeren kapalı bir kapta tamponlu formalin 3 içinde yer alır . Florokrom analizi fluorochromes ışığa duyarlı olarak, olması ise, minimal ışığa maruz kalma olun.
  2. Doku hangi yönlendirme gerekli olacak kurulması.
  3. Numune boyutuna kesin, doğru yönde, bir grup gördüm. Emin olun güvenlik önlemleri yapıştırılır. Numune sonra opak bir kap içine konur, hacmi yeterli fiksasyon elde etmek için yaklaşık on katı numune boyutu olmalıdır. Numune boyutuna bağlı olarak bir ila iki hafta olmak üzere toplam formalin kalmalıdır. Bu kontrolü doku testi ve optimizasyonu amaçlar için kullanılmasını önerdi.
  4. Doku gömme kalıp sığar doku ve% 70 etanol içeren, kapalı bir opak kap içine yerleştirin.
  5. Işık ve sürekli ajitasyon altında koruyucu, etanol konsantrasyonları artan doku işleyin.
    1. % 70 etanol 1 hafta
    2. % 80 etanol 1 hafta
    3. % 90 etanol 1 hafta
    4. % 100 etanol 1 hafta
  6. Daha sonra doku, ışık ve sabit ajitasyon altında tekrar koruyucu 1 hafta bütanol temizlenir.
  7. Reçine ve kemik yoğunluğu yakından reçine yoğunluğu (bkz. adım 8) değiştirilebilir eşlemeli ve doğru yoğunluğu sağlamak için ilk olarak bir test örneğinin gömme tavsiye edilmelidir. Biz ışık mikroskobu ve florokrom analiz için Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) kullanın. Immünohistokimya gerekiyorsa alternatif bir reçine gibi Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) olarak kullanılması gerekir.
  8. Technovit 7100 hazırlık çözüm gerekirse, kit ile birlikte verilen yumuşatıcı çözüm küçük alikot ile karışık olabilir, ancak en fazla 5% hazırlık çözüm hacim; deneyimlerimiz yumuşama çözüm nadiren gereklidir. Mutlak etanol ve baz sıvı Technovit 7100 eşit parçaya 24 saat ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir ön infiltrasyon çözüm olarak ve ajitasyon ile karıştırılır ve doku uygulanır.
  9. Infiltrasyon çözüm sonra, 100 ml tabanı sıvı içinde çözünmüş 1 gr sertleştirici I (= 1 torba) kullanılarak yapılır. Bu ön infiltrasyon çözüm yerine sürekli ajitasyon altında 1 hafta sızmak için izin verilir.
  10. Aşağı kesim yüzeyi yüz doku, kalıp içine yerleştirin. (Ideal olarak en az 5 milimetre) reçine için doku etrafında bir marj var olduğundan emin olun; bu blok gücü sağlar. 1 sertleştirici II ml Technovit 7100 hazırlık çözüm 15mls karıştırın ve kalıp numune etrafında dökün ve en az 5 millimietres kapağı. Kür 2 saat içinde başlayacaktır, ancak bir gecede tamamlanmış olacaktır.
  11. Montaj Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) kullanarak bir yedekleme blok fashioning sonra yapılır. Toz 1 kısım sıvı viskoz bir sıvı elde etmek için 2 parça bir hacim oranı 3040 Technovit karıştırın. Technovit 3040 blok blok temel üzerinde en az 2 mm bir seviyeye geri girinti içine dökün. Yaklaşık 10 dakika sonra kalıp uzak soyulmuş ve blok hazır olabilir.
  12. Yoğunluğu ve bu nedenle metakrilat reçine kesme özellikleri, odadaki ortam nem duyarlı. Bloklar dolayısıyla desikatöre saklanmalıdır.
  13. Zemin kesit kalınlığı 20-50 mikrometre arasında büyük bölümleri üretir. Kalın bölümlerde parlak floresan üreten (bölümüne bakınız) florokrom analizi için yararlı olur. Macrotome elmas bıçak sabitleyin. Macrotome rezervuar yağ, petrol ruhu gibi ekleyin. Güvenli ve kelepçe blok bıçak yolunuzu. İzin yeterli yağlama sağlar (Bölüm başına yaklaşık 20-30 dakika) yavaş yavaş ortaya taşlama. Ilk bölümü kesme yüzünü ortaya çıkarır ve bölümü atılmalıdır yönlendirir.
  14. Bir sonraki bölümde, ardından bir SuperFrost Plus slayt yerleştirilir. Bu bölüm, bunun üzerinde bir sandviç torbası bir kısmını yerleştirerek ve daha sonra başka bir slayt yerde kelepçeli düz tutarak tavsiye ederiz kıvrılabilecek. Daha sonra 1 saat boyunca sıcaklık 60-80 derece arasında bir inkübatör içine yerleştirilir. Bu metakrilat yumuşatır ve düz bir şekilde slayt bölümünde uymak yardımcı olur.
  15. Nazik bir şekilde ince kum zımpara kullanarak gerekli zemin bölümünde temizlenir ve parlatılır olabilir.
  16. Kızak mikrotom, ince kesitler keser ışık microsocopy için en iyi bölümleri sağlar. Bu sabit bloklar kesim için gerekli sertliği, gibi bir kızak mikrotom kullanın. Alternatif olarak çalışan döner mikrotom kullanılabilir. Keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanın. Bu bir kullanılan diğer olarak bilenmiş olarak kullanılabilir iki ağza sahip olmak tercih edilir. Bıçak bloğu ile 45 derecelik bir açı yapmalıdır. Surface yumuşatma gerekirse engellemek için ıslak bir kağıt uygulayarak elde edilebilir. Bu kaliteli bir bölümünü elde etmek için istenilen kesme koşulları elde etmek için çeşitli bölümler sürebilir. Bu bölüm, daha sonra bir su banyosu üzerinde yüzen ve 16 olduğu gibi bir slayt yerleştirilir.
  17. Boyama reaktifler, aşağıda Malzeme listelenmiştir. Protokoller, Bancroft 4 ve ark . Kalınlık değişimi nedeniyle test slaytlar üzerinde lekeler optimize etmek için tavsiye edilir. Raf boyama doku gerekebilir doğrudan düz bir slayt lekeleri ekleyerek böylece slayt float neden olabilir. Özdeş bir protokol ya da raf boyama histomorfometri için gerekli tutarlı boyama sonuçlar için gereklidir.
    1. Hematoksilen ve Eosin
      1. Haematoxyilin 5-10 dakika ile Leke
      2. Scott, musluk suyu ile yıkayın
      3. Eozin 5 dakika ile Leke
      4. Musluk suyunda yıkayın
      5. Ksilen içinde Temizle
      6. Dağı
      7. Sonuçlar
        1. Osteoid = Pembe
        2. Kalsifiye kemik = morumsu kahverengi
        3. Çekirdekler = mavi
    2. Von Kossa
      1. Gümüş nitrat çözeltisi koyun ve güçlü ışığa maruz mineralize kemik siyah olana kadar (yaklaşık 10 dakika)
      2. Üç kez distile su ile yıkayın
      3. 5 dakika boyunca sodyum tiyosülfat ile Tehdit
      4. Distile su ile yıkayın
      5. Safrinin O ile Counterstain
      6. Ksilen içinde Temizle
      7. Dağı
      8. Sonuçlar
        1. Mineralised kemik = black
        2. Osteoid = kırmızı / pembe
    3. Masson Goldner s trikrom
      1. (% 80 etanol 90mls ve 20 dakika boyunca% 25 oranında amonyak 10mls) alkalin alkol ile yıkayın.
      2. Suyla yıkayın
      3. Distile su ile durulayın
      4. 10 dakika boyunca Weigert s Hematoksilen ile Leke
      5. Distile su ile durulayın
      6. Ponceau-Fuchsin nihai çözüm 5 dakika ile Leke
      7. % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın
      8. Phosphomolybdic asit-turuncu G çözüm 5 dakika içinde Leke
      9. % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın
      10. 5 dakika açık yeşil ile Leke
      11. % 1 asetik asit ile durulayın 3 değişiklik
      12. Distile su ile durulayın
      13. Dağı
      14. Sonuçlar
        1. Mineralised kemik = yeşil
        2. Osteoid = kırmızı / turuncu
        3. Çekirdekler = mavi gri
        4. Kıkırdak = mor
  18. Florokrom hazırlıkları:
  19. Bunlar en az iki hafta arayla, yavaş intravenöz enjeksiyonu ile idare edilmektedir.
  20. Dozlar
    1. Calcein Yeşil 10 mg / kg IV
    2. Oksitetrasiklin 50 mg / kg IV
    3. Alizarin Complexone 30 mg / kg IV
  21. Calcein Yeşil hazırlanması
    1. Calcein Yeşil Bir gram eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir.
    2. pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 NaOH ile ayarlanır.
    3. Filtre ve ışıktan korumalı tutmak
  22. Alizarin Complexone hazırlanması
    1. Üç gram Alizarin complexone eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir.
    2. pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 HCl veya NaOH ile ayarlanır.
    3. Filtre ve ışıktan korumalı tutmak
  23. Oksitetrasiklin, hazırlanması
    1. Oksitetrasiklin raftan bir anti-mikrobik ilaç olarak kullanılabilir. Herhangi bir hazırlama gerekli değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Acknowledgements: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Yazarlar, laboratuvar uzmanlık için reçine gömme ve Bayan Stephania Mezarları Bayan Sue Connell onun uzmanlık yardımı kabul etmek istiyorum. Yazarlar, onların tavsiyelerini Profesör Frank Kandziora ve Dr Marie-Anne Polboth teşekkür etmek istiyorum.

References: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

  1. Kerr, J. Atlas of Functional Histology, Harcourt Publishing, Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
  2. Parfitt, A.M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res 2, 595-610 (1987).
  3. An, Y.H. & Martin, K.l. Handbook of histology methods for bone and cartilage. Humana Press Inc, New Jersey, USA. 222 (2003).
  4. Bancroft, J.D. & Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. Churchill Livingston, Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).

Ask the Author: Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

1 Comment

Do you have any new or alternate protocols to decalcify the bones,except for EDTA and Nitric acid buffers to recommend?

1

Reply

Posted by: kadriye gokkanFebruary 26, 2010, 2:15 AM

This article is about undecalcified bone histology, however I would recommend formic acid for decalcifation if this is required.

1.1

Reply

Posted by: Tony GoldschlagerMarch 2, 2010, 4:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter