Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning

Deel 1: Voorbereiding Drosophila voor HRMAS metingen

1. Met behulp van standaard flylab procedures ^1, het verzamelen van nieuwe eclosing vliegt voor 3 dagen en overbrengen naar flacons met verse vliegen eten vliegen. Incubeer de verzamelde vliegt gedurende 5 dagen, zodat de vliegen zal worden 5-8 dagen oud vlak voor het experiment. Slechts een geslacht (meestal mannen) wordt gebruikt voor experimenten.
2. Gebruik gezonde, intacte wild type vliegt om te vergelijken met de behandelde bijvoorbeeld getraumatiseerd of genetisch veranderde vliegt ^1.
3. Plaats single vliegt in 2 ml buisjes met daarin een stuk (~ 0,2 ml) van de vlieg voedsel 24 uur voorafgaand aan het experiment. Deze buizen zijn voorzien van een gat in de buis cup gemaakt met behulp van een vlam verwarmd insuline naald.
4. Weeg onmiddellijk de buizen voor en na de vlieg inbrengen met behulp van een hoge precisie balans en om elk vliegt het gewicht door het aftrekken van de eerste waarde van de laatstgenoemde. Een enkele mannelijke vlieg weegt meestal 0,7-1 mg.

Deel 2: HRMAS Rotor voorbereiding.

1. Plaats een enkele buis op ijs voor minder dan een minuut aan het vliegen binnen verdoven.
2. Leg de vlieg op een laag aluminiumfolie op ijs geplaatst en duw de vlieg in de halfronde holle ruimte van de NMR rotor te voegen met een zachte borstel om te voltooien vliegen plaatsing te zorgen terwijl het vermijden van vliegen letsel.
3. Plaats het in te voegen in het zirkonium oxide (ZrO ₂₎ rotorbuis (4 mm diameter, 50 ul) om de vliegen tussen de rotor te voegen en de onderkant van de rotor (zie figuur 1) te vinden.
4. Sluit de insert met een schroef en bedek het met parafilm (zie figuur 1) om het contact te voorkomen tussen de vliegen en de TSP standaard-oplossing (TSP: trimethylsilyl-propionzuur-2 ,2,3,3-d4 zuur, Mw = 172, δ = 0,00 ppm, 50 mM in gedeutereerd water-D ₂ O, die fungeren als een referentie voor zowel de resonantie chemische verschuiving en kwantificatie).
5. Voeg 8 ul van TSP standaardoplossing op de top van de rotor in te voegen. (Zie figuur 1).
6. Veilig en draai het geheel in de rotoren met een top kapje (zie figuur 1).

Deel 3: HRMAS Data Acquisition

1. Breng de rotor in de HRMAS sonde en plaats deze op de magische hoek van 54,7 ° (zie figuur 1).
2. Ingestelde temperatuur op 4 ° C door een BTO-2000 unit in combinatie met de MAS pneumatische unit. Vliegen zijn bewaard bij 4 ° C, terwijl in de spectrometer om de anesthesie te onderhouden.
3. Stel de HRMAS ¹ H MRS spinning snelheid 2 kHz MAS.
4. Het stabiliseren van de MAS rotatie frequentie op 2,0 ± 0.001 kHz door een MAS snelheidsregelaar (Rotation frequentie).
5. Voor magneet voorbereiding: afstemmen en overeenkomen met de spoel voor optimale prestaties en vulplaatje de magneet voor optimale kwaliteit van de spectra.
6. Verwerven eendimensionale ^een H spectra met behulp van rotor gesynchroniseerde Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin-echo pulssequentie ^2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) _{n-acquisitie],} dat als een T _2-filter werkt aan Verwijder de spectrale verbreding ¹ H NMR single-fly spectra een-dimensionale gegevens verkregen over alle monsters. Synchroniseer de inter-puls vertraging (τ = 500μs) om de MAS rotatie frequentie (2 kHz). Stel het aantal passanten op 256 met 32.768 (32k) data punten. Acquisitie tijd 9 min.
7. Acquire tweedimensionale (2D) ^{een H-1} H NMR HRMAS single-fly spectra van alle monsters met behulp van een TOBSY sequentie met adiabatische pulsen 3. Acquisitie parameters zijn: 2k datapunten direct dimensie (11 ppm spectrale breedte), een s water pre-verzadiging tijdens de ontspanning vertraging, 8 scans per increment, 128 stappen, totaal herhaling 2 s tijd, 45 ms mengtijd, en een totale overname tijd van 29 minuten.

Deel 4: Data Processing / Analyse

1. Analyseer de MRspectra van monsters met behulp van MestReC software (Mestrelab Research, www.mestrec.com)
2. Gebruik een line-verbreding apodization functie van de 0,5 Hz en gelden voor alle HRMAS ^een H FID voorafgaand aan de Fourier transformatie.
3. Verwijzen naar de MR spectra met betrekking tot de TSP bij δ = 0,0 ppm (externe standaard).
4. Fase spectra handmatig toe te passen en een Whittaker baseline schatter en de brede onderdelen van de baseline af te trekken voorafgaand aan de piekoppervlak berekeningen.
5. Schatting piek gebieden met behulp van MestReC software. Schaal piekhoogten met betrekking tot de TSP voor elke verworven spectrum (TSP piekhoogte = 1). Gebruik t-tests (tweezijdig, p <0,05) naar binnen-groep te vergelijken met tussen-groepen ratio's.
6. 2D TOBSY procesparameters zijn: QSINE = 2 window functie in beide dimensies, FT met 2k punten in de directe dimensie en nul-vulling 1k in de tweede dimensie, fase correctie in beide richtingen en de baseline-correctie in de tweede dimensie.
7. Maak de 2D-spectra met behulp van het programma (Sparky TD Goddard en DG Kneller, SPARKY 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/home / sparky /)

Deel 5: Vertegenwoordiger Spectra van Live Drosophila melanogaster Flies

De hierboven beschreven procedures toe te reproduceerbaar spectra te verzamelen van levende Drosophila melanogaster vliegen. Figuren 2 en 3 tonen vertegenwoordiger MR spectra verworven in wild-type (WT) Oregon-R vliegen. Figuur 2 geeft ^een 1D H HRMAS CPMG spectra. Belangrijkste lipide componenten [C H ₃ (0.89 ppm), (C H ₂₎ n (1.33 ppm), C H ₂ C-CO (1.58ppm), C H ₂ C = C (2,02 ppm), C H ₂ C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm)], glycerol (1,3-C H 4,10 ppm en 4,30 ppm; 2-CH ₂ 5.24 ppm), en kleine metabolieten: β-alanine (β-Ala werden 2,57 ppm), acetaat (Ac, 1,97 ppm), fosfocholine (PC, 3,22 ppm) en phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) ontdekt en ingedeeld in overeenstemming met eerdere rapporten 4, 5. Signalen op 2,02 ppm werden ingedeeld in methyleen protonen van de C H2-CH = CH-groep van mono-onverzadigde vetzuren (dat wil zeggen palmitoleic). De onverzadigde vetzuren werden geïdentificeerd door een signaal bij 5,33 ppm geproduceerd door protonen van de-CH = CH-groep. Kleine metabolieten die niet konden worden toegewezen of werden niet zichtbaar met behulp van de 1D spectrum werden gedetecteerd met behulp van ^{2D-1 H-1} H TOBSY HRMAS (zie figuur 3).

Figuur 1. Experimentele opzet van in vivo HRMAS 1H MRS voor het onderzoek van levende Drosophila op 14,1 T. Externe standaard trimethylsilyl-propionzuur-2 ,2,3,3-d4 zuur in gedeutereerd water (TSP / D ₂ O). Op het plein: rotor positie op de magische hoek in HRMAS sonde.

Figuur 2. In vivo 1D HRMAS ^een H CPMG spectra van een live-Drosophila melanogaster gew vliegen. Lipide componenten: C H ₃ (0.89 ppm), (C H ₂₎ n (1.33 ppm), C H ₂ C-CO (1.58ppm), Acetaat (Ac), C H ₂ C = C (2,02 ppm), C H ₂ C = O (2,24 ppm), β-alanine (β-Ala), fosfocholine (PC) en phophoetanolamine (PE), Glycerol (1,3-C H 4,10, 4,30 ppm; 2-C H ₂ 5.22 ppm) , C = C H H (5,33 ppm).

Figuur 3. In vivo 2D 1H-1H TOBSY HRMAS spectrum van een live-Drosophila melanogaster wt vliegen op 14,1 T. Kleine metabolieten en lipide componenten werden geïdentificeerd. Metabolieten: alanine (Ala), β-alanine (β-Ala), arginine (Arg), glutamine (Gin), glutamaat (Glu), PC fosfocholine (PC), phophoetanolamine (PE), Taurine (Tau), α-glucose (α-GLC) en glycerol. Lipiden componenten: C H ₃ (0.89 ppm), (C H ₂₎ n (1.33 ppm), C H ₂ C-CO (1,58 ppm), C H ₂ C = C (2,02 ppm), C H ₂ C = O (2,24 ppm), C = C H H (5,33 ppm).

Met uitzondering van het recente verslag van de haalbaarheid van in vivo MRI in fruitvliegen ^6, hebben in vivo MRS studies in Drosophila nog niet gemeld. In het huidige protocol beschrijven we de implementatie van een nieuw in-vivo-HRMAS ¹ H-MRS aanpak voor de detectie van biologisch belangrijke moleculen. Concreet hebben we ontdekt lipiden en kleine metabolieten in levende Drosophila vliegt op 14,1 T in ongeveer 45 min, wat voldoende overname de tijd het toelaat, terwijl het bereiken van nul vliegen sterfte. Het gebruik van een rotor-gesynchroniseerde Wurst-8 adiabatische puls (C9 ^een ₁₅₎ in TOBSY ons toegestaan ​​om een bevredigende SNR en een goede resolutie van weefsel spectra met betrekking tot het gebruik van een isotrope mengen puls (MLEV-16) te verkrijgen, in overeenstemming met eerdere rapporten ^{3, 7.} Ons vermogen om TOBSY te gebruiken om een betere metabole profiel van Drosophila detecteren suggereert dat TOBSY gebruikt met 1D CPMG is goed geschikt voor de gelijktijdige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de metaboliet concentraties en maakt een betere evaluatie van metabole dysfunctie in Drosophila.

Onze aanpak biedt biomarkers van biomedische paradigma's te onderzoeken, terwijl het bevorderen van de ontwikkeling van nieuwe in vivo niet-destructief onderzoek benaderingen in Drosophila, en kunnen dus nieuwe therapeutische ontwikkeling direct.